Recuperação e purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli e remoção de endotoxina utilizando adsorção em leito expandido
Adsorção em leito expandido, Triton X-114, remoção de LPS, purificação de proteínas, Leishmania infantum chagasi.
O crescente interesse e aplicações dos produtos biotecnológicos vêm aumentando o desenvolvimento de novos processos de recuperação e purificação de proteínas. A adsorção em leito expandido (ALE) tem se destacado como uma técnica promissora para essa finalidade, pois combina em uma única etapa os passos de clarificação, concentração e purificação da molécula alvo, reduzindo assim o tempo e os custos de operação. Entretanto, um problema inerente à produção de proteínas recombinantes é a presença de endotoxinas (LPS), uma vez que este é um componente natural de sistemas de expressão bacteriano, amplamente utilizado na produção de proteínas recombinantes. Neste contexto, o objetivo desta tese foi avaliar a recuperação e purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli M15 e a remoção de endotoxina por ALE. Escherichia coli recombinante foi cultivada em meio 2xTY utilizando biorreator de bancada e a expressão da proteína de interesse induzida com lactose 10 g/L. Para definir as condições ótimas de adsorção e eluição na resina Streamline chelating, foram realizados ensaios em taques agitados sob a forma de planejamento experimental, mostrando que o pH 8,0 e a concentração de NaCl 1,625 M favoreceram a adsorção do antígeno à resina. Para a eluição, o único fator significativo foi a concentração de imidazol, que foi definida em 600 mM. A isoterma de adsorção do antígeno 503 foi realizada utilizando as melhores condições de adsorção no planejamento experimental, mostrando bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores de qmax (capacidade máxima de adsorção) e Kd (constante de equilíbrio) estimados foram de 1,95 mg/g de adsorvente e 0,34 mg/mL. Nos ensaios de adsorção usando o leito na forma expandida foi utilizada uma coluna de 2,6 cm de diâmetro por 30,0 cm de altura, acoplada a uma bomba peristáltica. Os ensaios no leito expandido com o homogeneizado de E. coli M15 não clarificado mostraram que o expoente de Richardson-Zaki (n) foi igual a 4,4 e a velocidade terminal de 2,73 cm/h. Através dos testes de purificação diretamente do extrato não clarificado obteve-se uma recuperação de 59,2% da biomolécula e um fator de purificação de 6,0. A adição do tensoativo não-iônico Triton X-114 à etapa de lavagem da ALE proporcionou altos valores de remoção do LPS inicialmente presente nas amostras para todas as condições estudadas (>99%). O processo de purificação por ALE empregado para remoção de LPS contaminante presente no meio contendo o antígeno 503, demostrou ser eficiente em recuperar a biomolécula-alvo e remover seu principal contaminante em apenas uma operação. Portanto, pode ser empregado como primeira etapa para a remoção de elevadas concentrações de LPS na purificação de proteínas recombinantes.