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Dissertações |
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MARIA KAROLAYNNE DA SILVA
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Desenvolvimento de uma Vacina de Subunidade multi-epítopo contra um Arbovírus Negligenciado das Américas: uma abordagem por Imunoinformática e Modelagem Molecular
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Orientador : JONAS IVAN NOBRE OLIVEIRA
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MEMBROS DA BANCA :
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JONAS IVAN NOBRE OLIVEIRA
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JOAO FIRMINO RODRIGUES NETO
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CLAUDIO BRUNO SILVA DE OLIVEIRA
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Data: 30/03/2023
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O vírus Mayaro (MAYV) é um arbovírus emergente nas Américas que pode causar doenças artritogênicas debilitantes. Embora a biologia do MAYV não seja totalmente compreendida, sabe-se que é amplamente derivada de alfavírus artritogênicos relacionados, como os vírus chikungunya, Ross River e O’nyong nyong. O controle efetivo da disseminação dessas doenças requer a identificação dos indivíduos infectados e o desenvolvimento de terapias preventivas e profiláticas. No entanto, atualmente, a única abordagem disponível para o controle do MAYV é o controle do vetor, já que não existem vacinas licenciadas para prevenir a infecção por MAYV nem terapêutica para tratá-la. Neste estudo, utilizamos abordagens imunoinformáticas e de modelagem molecular para identificar potenciais epítopos de células T para a vacinação contra o vírus Mayaro. Para isso, analisamos 127 genomas de MAYV sequenciados nas Américas (08 Bolívia, 72 Brasil, 04 Guiana Francesa, 05 Haiti, 20 Peru, 04 Trinidad e Tobago e 14 Venezuela) e identificamos sequências de proteínas curtas que podem se ligar aos alelos do MHC classe I e classe II. Esses epítopos promíscuos foram selecionados com base em sua conservação e imunogenicidade. Através de análises de imunoinformática e modelagem molecular, identificamos 56 potenciais epítopos para MHC-I/TCD8+ e 29 para MHC-II/TCD4+, sendo que apenas algumas sequências específicas de proteínas (nsP1191-199, nsP1501-509, nsP1498-506, nsP3348-356, nsP4305-314 e nsP4212-221(nsP157-71, nsP116-30, nsP1182-196, nsP1180-194, nsP115-29, nsP2640-654, nsP2639-653 , nsP2679-693, nsP2677-691, nsP2680-694, nsP3127-141, nsP362-76, nsP4414-428, nsP4413-427, nsP4412- 426 e nsP4372-386) TCD8+ (TCD4+) exibiram alta antigenicidade, conservação, não-alerge nicidade, não-toxicidade e excelente cobertura populacional. Com base nesses resultados, desenvolvemos uma vacina multiepítopo acoplada ao receptor TLR3 e aprimoramos sua qualidade por meio de cálculos de mecânica quântica. Esses resultados têm implicações importantes para o avanço do diagnóstico, desenvolvimento de vacinas e intervenções imunoterapêuticas contra o vírus Mayaro.
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The Mayaro virus (MAYV) is an emerging arbovirus in the Americas that can cause debilitating arthritogenic diseases. Although the biology of MAYV is not fully understood, it is known to be closely related to arthritogenic alphaviruses such as chikungunya, Ross River, and O’nyong nyong viruses. Effective control of the spread of these diseases requires identification of infected individuals and the development of preventive and prophylactic therapies. However, currently, the only available approach for controlling MAYV is vector control, as there are no licensed vaccines to prevent MAYV infection or therapies to treat it. In this study, we used immunoinformatics and molecular modeling approaches to identify potential T cell epitopes for vaccination against the Mayaro virus. To do this, we analyzed 127 MAYV genomes sequenced in the Americas (08 Bolivia, 72 Brazil, 04 French Guiana, 05 Haiti, 20 Peru, 04 Trinidad and Tobago, and 14 Venezuela) and identified short protein sequences that can bind to MHC class I and class II alleles. These promiscuous epitopes were selected based on their conservation and immunogenicity. Through immunoinformatics and molecular modeling analyses, we identified 56 potential MHCI/TCD8+ and 29 potential MHC-II/TCD4+ epitopes, with only specific protein sequences (nsP1191-199, nsP1501-509, nsP1498-506, nsP3348-356, nsP4305-314 and nsP4212-221(nsP157-71 , nsP116-30, nsP1182-196, nsP1180-194, nsP115-29, nsP2640-654, nsP2639-653, nsP2679-693, nsP2677-691 , nsP2680-694, nsP3127-141, nsP362-76, nsP4414-428, nsP4413-427, nsP4412-426 and nsP4372-386) TCD8+ (TCD4+) exhibiting high antigenicity, conservation, non-allergenicity, non-toxicity, and excellent population coverage. Based on these results, we developed a multiepitope vaccine coupled to the TLR3 receptor and improved its quality through quantum mechanical calculations. These results have important implications for advancing diagnosis, vaccine development, and immunotherapeutic interventions against the Mayaro virus.
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RONALD MURYELLISON OLIVEIRA DA SILVA GOMES
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APLICAÇÃO DOS ÍNTRONS DO GRUPO I DO MITOGENOMA DE CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS E CRYPTOCOCCUS GATTII PARA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES E SUA ASSOCIAÇÃO COM SUSCEPTIBILIDADE A ANTIFÚNGICOS
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Orientador : RAQUEL CORDEIRO THEODORO
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MEMBROS DA BANCA :
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RAQUEL CORDEIRO THEODORO
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SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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VANIA SOUSA ANDRADE
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MARCUS DE MELO TEIXEIRA
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Data: 17/04/2023
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Os complexos de espécies de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são compostos por fungos patogênicos que matam mais de 180.000 pessoas anualmente em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o principal sintoma da criptococose. Características como virulência e susceptibilidade a antifúngicos podem variar dentro de cada espécie segundo o genótipo fúngico: C. neoformans é dividido nos tipos moleculares VNI, VNII, VNIII e VNIV e C. gattii em VGI, VGII, VGIII e VGIV. Sendo assim, é necessário e urgente um diagnóstico diferencial com marcadores moleculares específicos. Os íntrons autocatalíticos do grupo I podem ser um alvo potencial para distinção entre os tipos moleculares dessas leveduras já que possuem polimorfismos quanto a sua presença e sequência de pares de bases. Além disso, como o auto-splicing destes elementos é vital para a célula fúngica, eles são considerados importantes alvos terapêuticos, uma vez que estão ausentes no genoma humano. Com base nisso, este estudo objetivou avaliar a presença de íntrons do grupo I nos genes mitocondriais cob e cox1 de isolados fúngicos do gênero Cryptococcus, buscar ORFs com genes de endonucleases nas sequências intrônicas, averiguar o potencial uso desses elementos genéticos como marcadores moleculares para diferenciação de genótipos e/ou espécies e analisar sua relação com a susceptibilidade a antifúngicos, além de estudar sua origem, distribuição e evolução através de análises filogenéticas. Os dados obtidos da amplificação de íntrons dos genes cob e cox1 mostraram que o complexo C. neoformans possui em média menos íntrons em seu mitogenoma e que há um grande polimorfismo de presença e de tamanho destes elementos entre e dentro dos genótipos, o que impossibilita o uso de um único marcador intrônico para diferenciar genótipo e/ou espécie nos complexos C. neoformans e C. gattii. Contudo, a diferenciação entre as espécies é possível com combinações de PCRs dos íntrons de mtLSU e cox1 para espécies de C. neoformans e dos íntrons de mtLSU e cob para C. gattii. Aproximadamente 80,5% dos íntrons sequenciados possuíam homing endonucleases e as análises filogenéticas mostraram que íntrons que ocupam o mesmo sítio de inserção formam clados monofiléticos e provavelmente possuem como ancestral comum um íntron que invadiu esse sítio antes da divergência entre as espécies. Houve apenas um caso de invasão heteróloga oriunda provavelmente de transferência horizontal entre um isolado do genótipo VGIV e a espécie de fungo liquenizado Arthonia susa. Quanto aos ensaios de susceptibilidade aos antifúngicos, viu-se que os valores de concentração inibitória mínima do Fluconazol, 5-Flucitosina e Pentamidina se mostraram estatisticamente associados aos complexos de espécies, tendo o C. gattii maiores MICs para o Fluconazol e o C. neoformans maiores MICs para 5-Flucitosina e Pentamidina. A presença de íntrons se mostrou relacionada com a susceptibilidade à Anfotericina-B, para a qual uma maior quantidade de íntrons esteve associada a menores valores de MIC e à 5-Flucitosina e Pentamidina, para as quais a influência da presença de íntrons variou entre os complexos: quanto à 5-Flucitosina, a presença de íntrons se relacionou com menor susceptibilidade em C. neoformans e maior em C. gattii, e o cenário oposto foi visto para Pentamidina, para a qual os íntrons estiveram associados à maior susceptibilidade em C. neoformans e menor em C. gattii.
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The species complexes of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are composed of pathogenic fungi that kill over 180,000 people annually worldwide, having meningoencephalitis as the main symptom of cryptococcosis. Characteristics such as virulence and antifungal susceptibility can vary within each species according to fungal genotype: C. neoformans is divided into molecular types VNI, VNII, VNIII, and VNIV, and C. gattii into VGI, VGII, VGIII, and VGIV. Therefore, specific molecular markers are necessary for differential diagnosis. Autocatalytic group I introns can be a potential target for distinguishing between molecular types of these yeasts, as they have polymorphisms regarding their presence and base pair sequences. Furthermore, since the auto-splicing of these elements is vital for the fungal cell, they are considered important therapeutic targets since they are absent from the human genome. Therefore, this study aimed to evaluate the presence of group I introns in the mitochondrial cob and cox1 genes of Cryptococcus fungal isolates, search for ORFs with endonuclease genes in intronic sequences, investigate the potential use of these genetic elements as molecular markers for differentiation of genotypes and/or species, and analyze their relationship with antifungal susceptibility andin addition to study their origin, distribution, and evolution through phylogenetic analyses. The data obtained from intron amplification of cob and cox1 genes showed that the C. neoformans complex has, on average, fewer introns in its mitogenome, and there is a great polymorphism of presence and size of these elements among and within genotypes, making it impossible to use a single intronic marker to differentiate genotype and/or species in the C. neoformans and C. gattii complexes. However, differentiation between species is possible with combinations of PCRs of mtLSU and cox1 introns for C. neoformans species and mtLSU and cob introns for C. gattii. Approximately 80.5% of the sequenced introns had homing endonucleases, and phylogenetic analyses showed that introns occupying the same insertion site form monophyletic clades and probably have a common ancestor that invaded this site before the species diverged. There was only one case of heterologous invasion, probably originating from horizontal transfer between a VGIV genotype isolate and the lichenized fungus Arthonia susa. Regarding susceptibility assays to antifungal agents, it was observed that the minimum inhibitory concentration (MIC) values of Fluconazole, 5-Flucytosine, and Pentamidine were statistically associated with species complexes, with C. gattii having higher MICs for Fluconazole and C. neoformans having higher MICs for 5-Flucytosine and Pentamidine. The presence of introns was related to susceptibility to Amphotericin B, for which a higher number of introns was associated with lower MIC values, and to 5-Flucytosine and Pentamidine, for which the influence of the presence of introns varied between complexes: regarding 5-Flucytosine, the presence of introns was related to lower susceptibility in C. neoformans and higher in C. gattii, and the opposite scenario was observed for Pentamidine, for which introns were associated with higher susceptibility in C. neoformans and lower in C. gattii.
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MARIANNA BARROS SILVA
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Caracterização de um condroitim-4-sulfato obtido de vísceras de tilápia (Oreochromis niloticus) e avaliação do seu efeito na modulação da cristalização do oxalato de cálcio
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Orientador : RAFAEL BARROS GOMES DA CAMARA
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MEMBROS DA BANCA :
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RAFAEL BARROS GOMES DA CAMARA
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MOACIR FERNANDES DE QUEIROZ NETO
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MOACIR FRANCO DE OLIVEIRA
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Data: 15/05/2023
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Glicosaminoglicanos (GAG) são polissacarídeos sulfatados citados como moduladores da formação de cálculos urinários, uma vez que estão presentes naturalmente na urina. Nesse contexto, a busca por possíveis moduladores do crescimento de cristais tem revelado o efeito promissor de um tipo de glicosaminoglicano, denominado condroitim sulfato (CS). Estudos revelam que os organismos aquáticos são fontes alternativas de condroitim sulfato com potencial terapêutico. Dentre as espécies marinhas, o peixe Oreochromis niloticus, conhecido como tilápia do Nilo foi escolhida para esse trabalho por representar 52% da produção nacional de piscicultura e gerar grande quantidade de rejeitos que podem causar danos aos ecossistemas naturais. o presente estudo teve como objetivo isolar condroitim sulfato de vísceras do O. niloticus e avaliar o efeito modulador desse composto no crescimento de cristais de oxalato de cálcio (OxCa). Para isso, os resíduos da tilapiocultura foram expostos a um processo de proteólise enzimática, seguido de complexação e descomplexação com resina catiônica Lewatit. Esse método permitiu obter uma mistura de GAGs, que em seguida foi exposta a técnicas de purificação baseadas em fracionamentos com acetona e cromatografia de troca iônica. Para caracterizar o material de estudo, foram realizadas análises de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e ressonância magnética nuclear demonstraram que o CS purificado era de um condroitim-4-sufato (CSA), e este passou a ser denominado de condroitim sulfato de tilápia (CST). Dentre os resultados obtidos o CST (0,01 mg/mL) diminuiu o tamanho dos cristais de OxCa e aumentou em 15 vezes o número de cristais formados. Ensaios de microscopia de fluorescência mostraram que o CST tem esse efeito por interagir com as faces do cristal monohidrato de OxCa (COM), mas não nos cristais di-hidratados. Já dados de miscroscopia eletrônica de varredura indicaram que CST altera a morfologia dos cristais COM, fazendo-os assumir uma forma mais longilínea do que aqueles observados no grupo controle. Em paralelo, dados obtidos com células Madin-Darby célula renal canina (MDCK) mostraram que CST não apresenta citotoxicidade nas condições avaliadas (0,01 – 0,2 mg/mL). Os dados mostram que o CST é um CSA e que esse modula a formação de cristais OxCa, o colocando em uma posição de um possível agente anti-calculo renal, porém ainda é necessário mais estudos principalmente in vivo.
Glicosaminoglicanos (GAG) são polissacarídeos sulfatados citados como moduladores da formação de cálculos urinários, uma vez que estão presentes naturalmente na urina. Nesse contexto, a busca por possíveis moduladores do crescimento de cristais tem revelado o efeito promissor de um tipo de glicosaminoglicano, denominado condroitim sulfato (CS). Estudos revelam que os organismos aquáticos são fontes alternativas de condroitim sulfato com potencial terapêutico. Dentre as espécies marinhas, o peixe Oreochromis niloticus, conhecido como tilápia do Nilo foi escolhida para esse trabalho por representar 52% da produção nacional de piscicultura e gerar grande quantidade de rejeitos que podem causar danos aos ecossistemas naturais. o presente estudo teve como objetivo isolar condroitim sulfato de vísceras do O. niloticus e avaliar o efeito modulador desse composto no crescimento de cristais de oxalato de cálcio (OxCa). Para isso, os resíduos da tilapiocultura foram expostos a um processo de proteólise enzimática, seguido de complexação e descomplexação com resina catiônica Lewatit. Esse método permitiu obter uma mistura de GAGs, que em seguida foi exposta a técnicas de purificação baseadas em fracionamentos com acetona e cromatografia de troca iônica. Para caracterizar o material de estudo, foram realizadas análises de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e ressonância magnética nuclear demonstraram que o CS purificado era de um condroitim-4-sufato (CSA), e este passou a ser denominado de condroitim sulfato de tilápia (CST). Dentre os resultados obtidos o CST (0,01 mg/mL) diminuiu o tamanho dos cristais de OxCa e aumentou em 15 vezes o número de cristais formados. Ensaios de microscopia de fluorescência mostraram que o CST tem esse efeito por interagir com as faces do cristal monohidrato de OxCa (COM), mas não nos cristais di-hidratados. Já dados de miscroscopia eletrônica de varredura indicaram que CST altera a morfologia dos cristais COM, fazendo-os assumir uma forma mais longilínea do que aqueles observados no grupo controle. Em paralelo, dados obtidos com células Madin-Darby célula renal canina (MDCK) mostraram que CST não apresenta citotoxicidade nas condições avaliadas (0,01 – 0,2 mg/mL). Os dados mostram que o CST é um CSA e que esse modula a formação de cristais OxCa, o colocando em uma posição de um possível agente anti-calculo renal, porém ainda é necessário mais estudos principalmente in vivo.
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Glycosaminoglycans (GAGs) are sulfated polysaccharides that are naturally present in urine and have been identified as modulators of urinary stone formation. Among GAGs, chondroitin sulfate (CS) has shown promise as a possible modulator of crystal growth. Studies have revealed that aquatic organisms are alternative sources of CS with therapeutic potential. The fish Oreochromis niloticus, also known as Nile tilapia, was chosen for this study due to its high production and potential for environmental damage. The objective of this study was to isolate CS from O. niloticus viscera and evaluate its modulating effect on calcium oxalate (OxCa) crystal growth. The tilapia culture residues were subjected to an enzymatic proteolysis process, followed by complexation and decomplexation with Lewatit cationic resin to obtain a mixture of GAGs. The GAGs were then purified using fractionation with acetone and ion exchange chromatography. The purified CS was identified as chondroitin-4-sulfate (CSA) and named tilapia chondroitin sulfate (CST). CST (0.01 mg/mL) was found to decrease the size of OxCa crystals and increase the number of crystals formed by 15 times. Fluorescence microscopy assays revealed that CST interacts with the faces of the CaOx monohydrate (COM) crystal, but not with dihydrate crystals. Scanning electron microscopy indicated that CST alters the morphology of COM crystals, making them assume a more elongated shape. Additionally, the study showed that CST does not present cytotoxicity under the evaluated conditions (0.01 – 0.2 mg/mL) in Madin-Darby canine renal cell (MDCK) cells. These findings suggest that CST has potential as an anti-kidney stone agent, but further in vivo studies are needed to confirm its efficacy.
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TATIANA DOS SANTOS PAIS
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AVALIAÇÃO DA TERATOGENICIDADE E TOXICIDADE EM PEIXE-ZEBRA (Danio rerio) DO EXTRATO BRUTO RICO EM CAROTENOIDES DE MELÃO CANTALOUPE (Cucumis melo L.) E NANONOENCAPSULADO EM GELATINA
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Orientador : ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
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MEMBROS DA BANCA :
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ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
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CHRISTINA DA SILVA CAMILLO
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THAIS SOUZA PASSOS
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KELLY ALENCAR SILVA
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Data: 14/09/2023
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O melão Cantaloupe apresenta uma polpa alaranjada rica em carotenoides, os quais podem promover diversos efeitos benéficos à saúde humana. Contudo, os carotenoides são extremamente instáveis a presença de oxigênio, luz, e ao calor, podendo ocasionar a redução das propriedades bioativas. Nesse contexto, a nanoencapsulação se apresenta como uma excelente estratégia para garantir a preservação e potencialização dos efeitos bioativos. Por outro lado, uma das grandes preocupações atuais está relacionada aos efeitos de toxicidade dessas nanopartículas. Com isso, o objetivo desse estudo foi avaliar a teratogenicidade do extrato bruto rico em carotenoides do melão Cantaloupe (EB) e das nanopartículas a base de gelatina suína contendo EB (EGS) em modelo animal de peixe-zebra (Danio rerio). O EB foi obtido a partir do melão Cantaloupe (Cucumis melo L.) em processos que envolveram secagem da polpa de melão (55 ̊C/24 h) para a obtenção de farinha, maceração em etanol (1:4 p/v), e partição em hexano (1:1 v/v). As nanopartículas foram obtidas por meio da técnica de emulsificação óleo em água (O/A). Para a caracterização das nanopartículas quanto a morfologia, interações químicas, tamanho de partículas e eficiência de encapsulamento, foram realizadas análises de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), Difração a Laser e Eficiência de Incorporação (EI), respectivamente. Nos experimentos em modelo animal com peixe-zebra, para o teste de embriotoxicidade, os 308 embriões, distribuídos em 7 grupos foram expostos a concentrações de 12,5 mg/L e 50,0 mg/L de EB e EGS durante 96 horas pós fertilização (hpf) e com 7 dias pós fertilização (dpf) foi realizado o teste optomotor. Nos testes de toxicidade com peixe-zebra adultos, os 60 peixes foram distribuídos em seis grupos e expostos a concentrações de 12,5 mg/L e 50,0 mg/L de EB e EGS durante 96 horas, e então submetidos as análises de neurotoxicidade claro/escuro, tanque novo e social. Com base nos resultados de caracterização, EGS apresentou EI de 94% (4,04), superfície lisa, sem depressões, diâmetro de 88,7 nm (7,02) e índice de polidispersão de 0,41 (0,03). O FTIR evidenciou o surgimento de novas bandas vibracionais em EGS em comparação com EB, demonstrando novas interações químicas. Nos experimentos em modelo animal, após exposição por 96 hpf, não foram observadas anomalias nos grupos tratados com EB e EGS, e os batimentos cardíacos se mantiveram entre 132 e 138 rpm dentro do esperado para embriões, semelhante aos grupos controle negativo e DMSO. Os grupos que receberam EB e EGS não apresentaram alterações morfológicas significativas. O nível de mortalidade se apresentou abaixo de 20% revelando não haver um caráter embriotóxico e nem teratogênico para EB e EGS nas concentrações utilizadas. Houve uma melhora significativa na resposta visual motora das larvas exposta ao EB e EGS que pode ser atribuída ao poder antioxidante e precursor de vitamina A dos carotenoides. Não foram identificados efeitos adversos no comportamento dos adultos, todos foram similares ao comportamento do grupo controle, sem sinais de ansiedade, estresse, nem alterações no nado, velocidade, sociabilidade que indicassem qualquer tipo de toxicidade. Portanto, foi constatado que EB e EGS mantiveram características encontradas em estudos anteriores comprovando a reprodutibilidade do método, não houve sinais de teratogenicidade, cardiotoxicidade ou neurotoxicidade nas larvas e tanto EB quanto EGS melhoraram a função cognitiva e de resposta no modelo avaliado. Os peixes adultos não apresentaram sinais de ansiedade ou qualquer outro indicio de toxicidade evidenciando que EB e EGS são potencialmente seguros.
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Mostrar Abstract
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Cantaloupe melon has an orange pulp rich in carotenoids, which can promote several beneficial effects on human health. However, carotenoids are extremely unstable in the presence of oxygen, light, and heat, which may reduce their bioactive properties. In this context, nanoencapsulation is an excellent strategy to ensure the preservation and enhancement of bioactive effects. On the other hand, one of the major current concerns is related to the toxicity effects of these nanoparticles. Therefore, this study aimed to evaluate the teratogenicity of the crude extract rich in carotenoids from Cantaloupe melon (CE) and of the porcine gelatin-based nanoparticles containing CE (EPG) in an animal model of zebrafish (Danio rerio). The CE was obtained from Cantaloupe melon (Cucumis melo L.) in processes that involved drying the melon pulp (55 ̊C/24 h) to obtain flour, maceration in ethanol (1:4 w/v) and partition in hexane (1:1 v/v). The nanoparticles were obtained using the oil-in-water (O/W) emulsification technique. For the characterization of nanoparticles in terms of morphology, chemical interactions, particle size and encapsulation efficiency, Scanning Electron Microscopy (SEM), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), Laser Diffraction and Incorporation Efficiency (IE) analyses were carried out (IE), respectively. In the experiments in an animal model with zebrafish, for the embryotoxicity test, the 308 embryos, divided into seven groups, were exposed to concentrations of 12.5 mg/L and 50.0 mg/L of CE and EPG during 96 hours post fertilization (hpf) and seven days post fertilization (dpf) the optomotor test was performed. In the toxicity tests with adult zebrafish, the 60 fish were divided into six groups exposed to 12.5 mg/L and 50.0 mg/L of CE and EPG for 96 hours, and then submitted to light/dark neurotoxicity, new and social tank. Based on the characterization results, EPG showed an IE of 94% (4.04), a smooth surface without depressions, a diameter of 88.7 nm (7.02), and a polydispersion index of 0.41 (0.03). FTIR evidenced the emergence of new vibrational bands in EPG compared to CE, demonstrating new chemical interactions. In animal model experiments, no anomalies were observed after exposure to 96 hpf, in the groups treated with CE and EPG, and heartbeats remained between 132 and 138 rpm within the expected range for embryos, similar to the negative control and DMSO groups. The groups that received CE and EPG did not show significant morphological alterations. The mortality level was below 20%, revealing neither an embryotoxic nor teratogenic character for CE and EPG in the concentrations used. There was a significant improvement in the visual motor response of larvae exposed to CE and EPG, which can be attributed to the antioxidant power and vitamin A precursor of carotenoids. No adverse effects were identified on the behavior of adults, all were similar to the behavior of the control group, without signs of anxiety, stress, or changes in swimming, speed or sociability that would indicate any toxicity. Therefore, it was found that CE and EPG maintained characteristics found in previous studies, proving the method's reproducibility. There were no signs of teratogenicity, cardiotoxicity, or neurotoxicity in the larvae, and both CE and EPG improved cognitive function and response in the evaluated model. Adult fish showed no signs of anxiety or any other evidence of toxicity, showing that CE and EPG are potentially safe.
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ELISÂNGELA DA COSTA SILVA
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ANÁLISE DA TOXICIDADE DO BIOMATERIAL HIDROXIAPATITA FUNCIONALIZADA COM O ÍON ESTRÔNCIO (Sr-HA) EM
ZEBRAFISH (Danio rerio).
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Orientador : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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MEMBROS DA BANCA :
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SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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VANESSA DE PAULA SOARES RACHETTI
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CÉSAR KOPPE GRISÓLIA
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Data: 27/10/2023
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A hidroxiapatita (HA) é um componente inorgânico essencial encontrado no tecido ósseo humano, e sua compatibilidade com sistemas biológicos a torna amplamente aplicável em diversos campos biomédicos. A capacidade de incorporar íons diversos na estrutura da HA permite a modificação de suas propriedades, tornando-as mais semelhantes às do próprio tecido ósseo. Um desses íonsque pode ser incorporado é o estrôncio, conhecido por sua habilidade em estimular a atividade osteogênica. No entanto, osefeitosbiológicosdasnanopartículasdeHAfuncionalizadascom estrôncio (SrHA) ainda não são completamente compreendidos. Para abordar essa lacuna, foi realizado um estudo de embriotoxicidade utilizando zebrafish (Danio rerio), seguindo as diretrizes da OCDE 236. Os embriões de zebrafish foram expostos a microesferas contendo nanopartículas de nSrHA sintetizadas a temperaturas de 5 °C e 90 °C por 120 horas. Durante o teste, foi avaliado a taxa de mortalidade, os parâmetros de desenvolvimento e a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). Em 168 horas pós fertilização (hpf), parâmetros comportamentais foram avaliados por meio de respostas motoras e comportamento do tipo ansioso para verificar se os biomateriais causaram efeitos neurotóxicos. Os resultadosrevelaram que a taxa de sobrevivência diminuiunogrupoSrHAsintetizadoa5°C,ehouveumaumentona produção de ERO nesse grupo. No entanto, nenhum dos biomateriais causou alterações morfológicas que sugerissem toxicidade durante o desenvolvimento larval. Além disso, os testes comportamentais não mostraram diferenças significativas em nenhum dos grupos experimentais, sugerindo que a exposição aos biomateriais testados não teve efeitos neurotóxicos. Essas descobertasforneceminformaçõesvaliosassobreasegurançados biomateriais nanoestruturados à base de HA e destacam sua promissora aplicabilidade no reparo do tecido ósseo. Com o crescenteusodosbiomateriaisàbasedehidroxiapatita,éessencial investigações sobre a segurança dessesmateriais.
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Hydroxyapatite (HA) is an essential inorganic component found in human bone tissue, and its compatibility with biological systems makesitwidelyapplicableinvariousbiomedicalfields.Theabilityto incorporate different ions into the HA structure allows the modification of its properties, making them more similar to those of bone tissue itself. One of these ions that can be incorporated is strontium, known for its ability to stimulate osteogenic activity. However, the biological effects of strontium-functionalized HA nanoparticles(SrHA)arenotyetcompletelyunderstood.Toaddress this gap, an embryotoxicity study was performed using zebrafish (Danio rerio), following OECD 236 guidelines. Zebrafish embryos were exposed to microspheres containing synthesized nSrHA nanoparticles at 5 °C and 90 °C for 120 hours. The mortality rate, development parameters, and production of reactive oxygen species (ROS) were evaluated during the test. At 168 hours post fertilization (hpf), behavioral parameters were assessed through motor responses and anxiety-like behavior to verify whether the biomaterialscausedneurotoxiceffects.Theresultsrevealedthatthe survival rate decreased in the SrHA group synthesized at 5 °C, and there was an increase in ROS production in this group. However, none of the biomaterials caused morphological changes that would suggest toxicity during larval development. Furthermore,behavioral tests showed no significant differences in any experimental groups, suggesting that exposure to the tested biomaterials did not have neurotoxic effects. These findings provide valuable information on the safety of HA-based nanostructured biomaterials and highlight theirpromisingapplicabilityinbonetissuerepair.Withtheincreasing use of hydroxyapatite-based biomaterials, investigations into the safety of these materials areessential.
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NATHÁLIA CRISTINA LOPES DE JORGE
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Prospecção química, antioxidante e toxicológica das Esponjas Marinhas Suberites aurantiacus, Mycale angulosa e Halichondrida da Bacia Potiguar – RN
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Orientador : ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
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MEMBROS DA BANCA :
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ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
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HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
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DAYANNE LOPES GOMES
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Data: 10/11/2023
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As esponjas marinhas são organismos bastante promissores na busca por moléculas bioativas com uma gama de atividades biológicas já reportadas na literatura científica, com destaque para os agentes antioxidantes. Sabendo que o estresse oxidativo está associado a várias condições de saúde, tais como: câncer, Parkinson, Alzheimer, entre outros, a busca por compostos que atuem no controle oxidativo se torna elemento chave na busca por novos tratamentos. A Bacia Potiguar do RN possui um vasto litoral com uma rica diversidade de espécies de esponjas marinhas, mas que em contrapartida é pouco explorada quanto ao seu potencial biotecnológico. Neste trabalho, realizamos a prospecção química, antioxidante e toxicológica de três espécies de esponjas coletadas no litoral da Bacia Potiguar: Suberites aurantiacus, Mycale (Zygomycale) angulosa e Halichondrida. Foram realizadas extrações sequenciais com n-hexano (HE) e clorofórmio/metanol, cujos extratos obtidos somente com HE foram denominados: HESUB, HEMYC e HEHALI, e os extratos obtidos apenas com CM: CMSUB, CMMYC e CMHALI para S. aurantiacus, M. angulosa e Halichondrida, respectivamente. O rendimento dos extratos foi o fator determinante para a escolha dos extratos CM que seriam caracterizados quimicamente por GC/MS e a avaliados quanto à sua atividade antioxidante pelos métodos: Capacidade Antioxidante Total (CAT), poder Redutor, sequestro de íons (superóxido, DPPH, Radical Hidroxila (OH)) e atividade Quelante de Íons (Ferroso (Fe2+) e Cuproso (Cu2+)). Os extratos CM das três esponjas também foram submetidos a ensaios toxicológicos in vitro com eritrócitos humanos e in vivo com larvas de Tenebrio molitor. A caracterização química por GC/MS revelou a presença álcoois, alcaloides, compostos fenólicos e lipídios (destes, principalmente a classes dos esteróis). Nos testes antioxidantes in vitro os extratos apresentaram a capacidade de sequestrar os radicais DPPH (CMHALI 60,91% ± 3,05; CMSUB 59,32% ± 3,71 e CMMYC 53,78% ± 6,96 com 1000 µg/mL) e os radicais hidroxila (CMSUB 96% ± 0,04 na concentração de 2000 µg/mL; CMMYC 37% ± 0,17 e CMHALI 54% ± 0,086 com 1000 µg/mL de extrato) e de quelar íons cobre (CMHALI 113,5% ± 1,93; CMSUB 112,1% ± 5,81 e o CMMYC com 110,6% ± 3,19 de atividade com 25 µg/mL de amostra), com destaque para a atividade quelante de cobre para os três extratos. Os ensaios toxicológicos in vitro e in vivo revelaram que em ambos os testes, em diferentes concentrações, as amostras não apresentaram efeitos tóxicos. Além disso, foram realizados ensaios antibacterianos contra as bactérias patogênicas Staphylococcus aureus e Escherichia coli, porém não foi observada tal atividade. Os resultados aqui apresentados sugerem que as esponjas marinhas desse litoral possuem propriedades farmacológicas que podem ser investigadas visando o isolamento dos metabólitos que são responsáveis pelas atividades antioxidantes apresentadas. Além disso, existe a possibilidade de investigar o potencial desses metabólitos frente a outras atividades biológicas.
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Marine sponges are very promising organisms in the search for bioactive molecules with a range of biological activities already reported in the scientific literature, with an emphasis on antioxidant agents. Knowing that oxidative stress is associated with various health conditions, such as cancer, Parkinson's, Alzheimer's, among others, the search for compounds that act on oxidative control becomes a key element in the quest for new treatments. The Potiguar Basin of RN has a vast coastline with a rich diversity of marine sponge species, but, on the other hand, it is little explored in terms of its biotechnological potential. In this work, we conducted chemical, antioxidant, and toxicological prospecting of three species of sponges collected on the coast of the Potiguar Basin: Suberites aurantiacus, Mycale (Zygomycale) angulosa, and Halichondrida. Sequential extractions were carried out with n-hexane (HE) and chloroform/methanol, and the extracts obtained only with HE were named HESUB, HEMYC, and HEHALI, while the extracts obtained only with CM were named CMSUB, CMMYC, and CMHALI for S. aurantiacus, M. angulosa, and Halichondrida, respectively. The yield of the extracts was the determining factor for choosing the CM extracts that would be chemically characterized by GC/MS and evaluated for their antioxidant activity using the following methods: Total Antioxidant Capacity (CAT), Reducing power, ion sequestration (superoxide, DPPH, Hydroxyl Radical (OH)) and Ion Chelating activity (Ferrous (Fe2+) and Cuprous (Cu2+)). CM extracts from the three sponges were also subjected to toxicological tests in vitro with human erythrocytes and in vivo with Tenebrio molitor larvae. Chemical characterization by GC/MS revealed the presence of alcohols, alkaloids, phenolic compounds, and lipids (mainly sterol classes). In in vitro antioxidant tests, the extracts showed the ability to scavenge DPPH radicals (CMHALI 60.91% ± 3.05; CMSUB 59.32% ± 3.71 and CMMYC 53.78% ± 6.96 at 1000 µg/mL) and hydroxyl radicals (CMSUB 96% ± 0.04 at a concentration of 2000 µg/mL; CMMYC 37% ± 0.17 and CMHALI 54% ± 0.086 with 1000 µg/mL of extract) and chelating copper ions (CMHALI 113.5% ± 1.93; CMSUB 112.1% ± 5.81 and CMMYC with 110.6% ± 3.19 activity with 25 µg/mL of the sample), with a particular emphasis on the copper chelating activity for three extracts. In vitro and in vivo toxicological tests revealed that, in both tests, at different concentrations, the samples did not exhibit toxic effects. Furthermore, antibacterial tests were conducted against the pathogenic bacteria Staphylococcus aureus and Escherichia coli, but no such activity was observed. The results presented here suggest that marine sponges from this coast have pharmacological properties that can be investigated with a view to isolating the metabolites responsible for the antioxidant activities presented. Furthermore, there is the possibility of investigating the potential of these metabolites in relation to other biological activities.
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BEATRIZ HELENA DANTAS RODRIGUES DE ALBUQUERQUE
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CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES COM POTENCIAL PARA TRIAGEM SEMINAL: VÍRUS E DOENÇAS METABÓLICAS
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Orientador : DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
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MEMBROS DA BANCA :
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DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
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DANIELLE BARBOSA MORAIS
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JULLIANE TAMARA ARAUJO DE MELO CAMPOS
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KYVIA BEZERRA MOTA
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Data: 10/11/2023
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A infertilidade é uma condição que afeta milhões de casais em idade reprodutiva em todo o mundo, envolvendo tanto o sistema reprodutor masculino quanto o feminino. Embora os fatores masculinos contribuam para metade dos casos de infertilidade, uma parcela significativa desses casos permanece sem uma causa identificada. Isso sugere a possibilidade da existência de fatores etiológicos não caracterizados, que não são adequadamente avaliados pelas atuais investigações diagnósticas. Nesse contexto, o estudo realizado teve como objetivo a caracterização de marcadores moleculares e vírus associados à saúde masculina e à qualidade do sêmen. O primeiro capítulo apresenta uma revisão abrangente do viroma seminal humano. Foi observado que o número de pesquisas que investigam vírus que ocorrem no sêmen humano tem aumentado e, até o momento, esses estudos têm sido em sua maioria prospectivos ou relacionados a achados clínicos específicos. Através da análise conjunta de todos esses artigos, foram listados os vírus relacionados à piora dos parâmetros seminais e proposto um novo painel com os principais vírus já descritos que possivelmente afetam a fertilidade e a saúde masculina. Este painel pode auxiliar na avaliação da qualidade do sêmen e servir como ferramenta de investigação em casos de infertilidade. O segundo capítulo, teve por objetivo identificar genes relevantes para o diagnóstico e a detecção precoce de distúrbios metabólicos hereditários, usando bancos de dados renomados, como OMIM e Orphanet. Foram identificados 228 genes associados a distúrbios metabólicos, referidos aqui como GADM. Notavelmente, esses genes se distribuem por quase todos os cromossomos, com uma ausência notável no cromossomo Y. Em termos de variantes genéticas, o gene APOB destacou-se com o maior número registrado. Aprofundando na prevalência de fenótipos, os distúrbios do metabolismo dos aminoácidos emergiram como a categoria mais prevalente. Também foi observado que o padrão autossômico recessivo era dominante em termos de herança. Através de uma análise meticulosa de interações proteína-proteína, revelou-se uma rede intricada que liga genes de fenótipos altamente prevalentes a outros menos frequentes. Esse mapeamento tem implicações significativas, pois indica os genes-chave para futuras investigações. A partir desta pesquisa, foram estabelecidos painéis direcionados de genes primários para a triagem e diagnóstico de doenças metabólicas em variados contextos. Este estudo reforça a necessidade de integrar dados de interações proteína-proteína para iluminar os mecanismos subjacentes de fenótipos metabólicos e potencialmente descobrir novos alvos terapêuticos ou biomarcadores para estas condições. Em suma, os resultados desta dissertação contribuem para o avanço das estratégias de diagnóstico da infertilidade do fator masculino, bem como para uma compreensão mais substancial para o aconselhamento genético e reprodutivo das doenças metabólicas.
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Infertility is a condition that affects millions of couples of reproductive age worldwide, involving both the male and female reproductive systems. While male factors contribute to half of infertility cases, a significant portion of these cases remains without an identified cause. This suggests the possibility of unidentified etiological factors that are not adequately assessed by current diagnostic investigations. In this context, the conducted study aimed to characterize molecular markers and viruses associated with male health and semen quality. The first chapter provides a comprehensive review of the human seminal virome. It was observed that the number of studies investigating viruses occurring in human semen has increased, and thus far, these studies have mostly been prospective or related to specific clinical findings. Through the combined analysis of all these articles, viruses related to deteriorating seminal parameters were listed, and a new panel with the main viruses already described that possibly affect fertility and male health was proposed. This panel can assist in evaluating semen quality and serve as a research tool in cases of infertility. The second chapter aimed to identify genes relevant to the diagnosis and early detection of hereditary metabolic disorders, using renowned databases such as OMIM and Orphanet. A total of 228 genes associated with metabolic disorders, referred to as GADM here, were identified from the 372 records extracted from OMIM. Notably, these genes are distributed across nearly all chromosomes, with a notable absence on the Y chromosome. In terms of genetic variants, the APOB gene stood out with the highest number recorded. Delving into phenotype prevalence, amino acid metabolism disorders emerged as the most prevalent category. It was also observed that autosomal recessive inheritance was dominant. Through a meticulous analysis of protein-protein interactions, an intricate network linking genes with highly prevalent phenotypes to less frequent ones was revealed. This mapping has significant implications as it indicates key genes for future investigations. From this research, targeted panels of primary genes for screening and diagnosing metabolic diseases in various contexts were established. This study underscores the need to integrate protein-protein interaction data to illuminate the underlying mechanisms of metabolic phenotypes and potentially discover new therapeutic targets or biomarkers for these conditions. In summary, the findings of this dissertation contribute to advancing diagnostic strategies for male factor infertility and to a more comprehensive understanding of genetic and reproductive counseling for metabolic diseases.
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BELICIA SANTANA DA SILVA
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Caracterização e expressão gênica de cepas ambientais do gênero acinetobacter sp. na biodegradação de petróleo
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Orientador : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
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MEMBROS DA BANCA :
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LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
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THIAGO BRUCE RODRIGUES
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VÂNIA MARIA MACIEL MELO
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Data: 01/12/2023
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A poluição que advém do petróleo pode ter efeitos significativos e duradouros no meio ambiente. A biorremediação pode ser uma alternativa a essa problemática. Diversos estudos relatam o potencial biotecnológico para a biorremediação por Acinetobacter baumannii ambientais. Contudo, ainda é necessário expandir a compreensão dos mecanismos genéticos dessa espécie para maximizar seu potencial biotecnológico. Sendo assim, esse trabalho visa caracterizar cepas de Acinetobacter baumannii oleumficedula, identificar os genes relacionados com a biodegradadação de hidrocarbonetos, bem como a sua presença nas vias de degradação e analisar a expressão dos genes alvos. Para tanto, foram realizadas analises de produção de biossurfactantes, estimativa de degradação de hidrocarbonetos, analises de expressão dos genes e avaliação do genoma das cepas. A partir dessas analises, foi possível constatar a eficiência de todas as cepas na produção de biossurfactante, as cepas apresentaram uma estimativa de degradação de hidrocarbonetos que variou de 7,94 a 69,82%. Foram identificados aproximadamente 81 genes diferentes associados a biorremediação em 16 vias metabólicas distintas. Foi observado a expressão de 12 genes, todos eles foram regulados positivamente. Ao observar o contexto genômico a foi verificada a similaridade genética das cepas. Contudo, mesmo apresentando similaridades genéticas as cepas mostram diferenças fenotípicas significativas isso pode ser atribuído a presença de um regulador master ou regulon. Por fim, pode-se inferir que todas as cepas são promissoras para aplicação na degradação de hidrocarbonetos.
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Pollution from oil can have significant and long-lasting effects on the environment. Bioremediation can be an alternative to this problem. Several studies report the biotechnological potential for bioremediation by environmental Acinetobacter baumannii. However, it is still necessary to expand the understanding of the genetic mechanisms of this species to maximize its biotechnological potential. Therefore, this work aims to characterize strains of Acinetobacter baumannii oleumficedula, identify genes related to the biodegradation of hydrocarbons, as well as their presence in degradation pathways and analyze the expression of target genes. To this end, analyzes of biosurfactant production, estimation of hydrocarbon degradation, gene expression analysis and evaluation of the strains' genome were carried out. From these analyses, it was possible to verify the efficiency of all strains in the production of biosurfactant, the strains presented an estimate of hydrocarbon degradation that varied from 7.94 to 69.82%. Approximately 81 different genes associated with bioremediation were identified in 16 distinct metabolic pathways. The expression of 12 genes was observed, all of which were upregulated. By observing the gnomic context, the genetic similarity of the strains was verified. However, even with genetic similarities, the strains show significant phenotypic differences, which can be attributed to the presence of a master regulator or regulon. Finally, it can be inferred that all strains are promising for application in hydrocarbon degradation.
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ARIANA PEREIRA DA SILVA
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PROSPECÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO E IN VIVO DOS EXTRATOS DA SEMENTE DE CHAÑAR (GEOFFROEA DECORTICANS) (GILL. EX HOOK. ET ARN.) BURKART (FABACEAE).
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Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
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MEMBROS DA BANCA :
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KATIA CASTANHO SCORTECCI
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RAFAEL BARROS GOMES DA CAMARA
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CARLOS HENRIQUE SALVINO GADELHA MENESES
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Data: 22/12/2023
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O uso de plantas para fins medicinais é uma prática realizada desde os tempos diversas partes das plantas são utilizadas para esse fim, sendo que a sua utilização da-se como fonte terapêutica complementar A Geoffroea decorticans, conhecida popularmente como Chañar, é uma planta nativa do Chile, pertencente à família das Fabaceae, Todas as partes dessa planta possuem uso na medicina popular, indo desde atividade expectorante, incluindo distúrbios broncopulmonares e alívio das dores, além de atividade antioxidante e antinociceptiva No entanto, há poucos estudos relatando tais atividades com extratos da semente de Chañar. Posto isso, nosso trabalho teve como objetivo avaliar e caracterizar o potencial antioxidante, citotóxico e de proteção frente ao estresse oxidativo induzido por sulfato de cobre (CuSO4) dos extratos etanólico (EE) e aquoso (EA) da semente de Chañar utilizando metodologias in vitro e in vivo. Os dois extratos produzidos tiveram sua caracterização fitoquímica realizada por meio de HPLC – GC-MS/MS além de ensaios expectofotométricos como: compostos fenólicos totais e flavonoides totais. Posteriormente, foram realizados ensaios bioquímicos com o intuito de avaliar o potencial antioxidante in vitro por meio de cinco ensaios espectrofotométricos (Capacidade antioxidante total-CAT, poder redutor; 2,2-difenil-1-picril-hidrazil-DPPH; quelação de cobre e ferro) que visaram verificar os possíveis modos de ação pelos quais estes compostos bioativos estariam contribuindo com a manutenção da homeostase redox celular. Foi utilizada também a linhagem celular de fibroblastos 3T3 ATCCCCL-92 para avaliar a citotoxicidade, do EE e EA, bem como o papel protetivo dos extratos quando esta linhagem celular foi submetida ao agente estressor sulfato de cobre (CuSO4), além do potencial em induzir ou não a migração celular. Após a realização dos testes in vivo, os extratos foram testados em modelo animal invertebrado (Tenebrio molitor), foram realizados ensaios de sobrevivência onde foi avaliada a toxicidade dos extratos assim como a capacidade protetora contra estresse oxidativo por sulfato de cobre. Avaliando também parâmetros de melanização. Deste modo, os resultados obtidos por cromatografia detectaram a presença de metabólitos secundários como: Fitol; Alfa-tocoferol; Vitexina e Rutina. Os ensaios espectrofotométricos in vitro demonstram a capacidade antioxidante dos extratos atuarem por diferentes mecanismos de ação (inibindo, sequestrando e quelando). Enquanto que os ensaios em modelo celular 3T3 demonstraram a ausência de citotoxicidade do EE e EA, também conferindo proteção frente ao estresse por (CuSO4) e capacidade de migração celular. Em modelo animal os extratos mostraram mais uma vez a excelente capacidade protetora frente ao estresse oxidativo, capaz de combater radicais livres gerados, mitigando a melanização exacerbada pelo estresse e a ausência de modulação no processo de metamorfose do inseto. Tomados em conjunto os ensaios (in vitro e in vivo) os extratos EE e EA das sementes de Chañar são fonte de compostos bioativos com excelentes propriedades antioxidantes.
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The use of plants for medicinal purposes has been practiced since time immemorial. Various parts of plants are used for this purpose, and their use is as a complementary therapeutic source Geoffroea decorticans, popularly known as Chañar, is a plant native to Chile, All parts of this plant are used in folk medicine, ranging from expectorant activity, including bronchopulmonary disorders and pain relief, as well as antioxidant and antinociceptive activity. However, few studies are reporting such activities with Chañar seed extracts. That said, our work aimed to evaluate and characterize the antioxidant, cytotoxic and protective potential against oxidative stress induced by copper sulfate (CuSO4) of the ethanolic (EE) and aqueous (EA) extracts of Chañar seed using in vitro and in vivo methodologies. The two extracts produced were phytochemically characterized using HPLC - GC-MS/MS, as well as spectrophotometric tests such as total phenolic compounds and total flavonoids. Subsequently, biochemical tests were carried out to assess the in vitro antioxidant potential using five spectrophotometric tests (total antioxidant capacity-CAT, reducing power; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl-DPPH; copper and iron chelation) aimed at verifying the possible modes of action by which these bioactive compounds could be contributing to the maintenance of cellular redox homeostasis. The 3T3 ATCCCCL-92 fibroblast cell line was also used to assess the cytotoxicity of EE and EA, as well as the protective role of the extracts when this cell line was subjected to the stress agent copper sulfate (CuSO4), in addition to the potential to induce cell migration or not. After carrying out the in vivo tests, the extracts were tested on an invertebrate animal model (Tenebrio molitor). Survival tests were carried out to assess the toxicity of the extracts and their protective capacity against oxidative stress caused by copper sulfate. Melanisation parameters were also assessed. The results obtained by chromatography detected the presence of secondary metabolites such as phytol, alpha-tocopherol, vitexin and rutin. The in vitro spectrophotometric tests demonstrated the antioxidant capacity of the extracts to act by different mechanisms of action (inhibiting, sequestering and chelating). The tests on the 3T3 cell model demonstrated the absence of EE and EA cytotoxicity, also conferring protection against (CuSO4) stress and cell migration capacity. In the animal model, the extracts once again showed their excellent protective capacity against oxidative stress, capable of combating the free radicals generated, mitigating the melanization exacerbated by stress and the lack of modulation in the insect's metamorphosis process. Taken together (in vitro and in vivo), the EE and EA extracts of Chañar seeds are a source of bioactive compounds with excellent antioxidant properties.
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ANNA BEATRIZ SANTANA LUZ
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Modelos experimentais que simulam a digestão proteolítica humana e prospecção in sílico de peptídeos derivados do inibidor de tripsina purificado de sementes de tamarindo com potencial anti-SARS-CoV-2
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Orientador : ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
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MEMBROS DA BANCA :
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ADRIANA FERREIRA UCHOA
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ALEXANDRE COELHO SERQUIZ
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ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
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DAVI SERRADELLA VIEIRA
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NORBERTO DE KASSIO VIEIRA MONTEIRO
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RICHELE JANAINA ARAUJO MACHADO
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Data: 23/01/2023
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As proteínas são macromoléculas multifuncionais e também atuam como fontes de aminoácidos e energia. A hidrólise de proteínas também gera inúmeros peptídeos bioativos com diversas funções no organismo. Nesse contexto, as proteínas são fontes de produtos biológicos (que podem ser empregados para o controle e tratamento de diversas doenças humanas), tornando-se fortes candidatos para o manejo e tratamento de doenças como a COVID-19. Buscou-se investigar modelos experimentais que mimetizam a digestão humana e prospectar peptídeos provenientes do inibidor de tripsina purificado de sementes de tamarindo (ITTp). Os dois primeiros capítulos desse estudo são referentes a uma revisão sistemática (RS), e estão organizados da seguinte forma: o primeiro apresenta o protocolo de RS com registro no International Prospective Register of Systematic Reviews (sob o número CRD42020198709);e o segundo a RS, que reuniu estudos in vitro, nos quais contaram com a utilizaração de procedimentos metodológicos capazes de mimetizar a digestão gastrointestinal de proteínas. Os artigos foram selecionados de acordo com a estratégia: população do estudo, intervenções, controle, resultados e tipo de estudo. As buscas foram realizadas nas bases de dados Pubmed, Web of Science, Science direct, Embase, Biblioteca Virtual em Saúde e Scopus. A avaliação da qualidade metodológica foi executada por meio da ferramenta Office of Health Assessment and Translation. Foram selecionados 1.986 artigos, resultando em 20 estudos elegíveis. Os resultados procuraram descrever os procedimentos metodológicos empregados in vitro para simular a digestão de proteínas animais ou vegetais. O terceiro capítulo refere-se a um estudo in sílico de prospecção de peptídeos nativos e análogos com potencial anti-SARS-Cov-2, derivados do ITTp. Os peptídeos nativos foram obtidos a partir de clivagens enzimáticas do ITTp in sílicoe os análogos foram gerados por meio da substituição de aminoácidos nas sequências primárias dos peptídeos nativos. O potencial anti-SARS-CoV-2 foi investigado por meio da simulação por dinâmica molecular entre os peptídeos e os sítios de ligação da serino protease transmembranar 2 (TMPRSS2), necessária para a entrada do SARS-CoV-2 na célula do hospedeiro, gerando o pedido de patente: BR 10 2022 020330 0. A melhor energia potencial de interação ocorreu entre a TMPRSS2 e um dos peptídeos nativos obtido pela clivagem com a tripsina (-287.48 kJ.mol-1) e seu peptídeo análogo (-293.49 kJ.mol-1). Assim, ambos os peptídeos apresentaram muitos resíduos hidrofóbicos, propriedade físico-química comum entre os peptídeos que inibem a entrada de vírus envelopados, como o SARS-Cov-2, presentes em medicamentos para o tratamento de doenças relacionadas a esses vírus envelopados. Diante disso, essa pesquisa apresenta uma expressiva contribuição científica, visto que a RS agrupou dados importantes que propiciarão subsídios para o desenvolvimento de estudos relacionados à aplicação clínica de peptídeos bioativos, concluindo-se que, apesar de modelos experimentais dinâmicos in vitro serem mais precisos, os modelos estáticos podem ser utilizados para simular a digestão proteolítica humana, desde que sejam controladas as condições fisiológicas e haja uma comparação com estudos in vivo para garantir maior precisão dos resultados. Ademais, o estudo in sílico gerou, a partir da clivagem do ITTp 56/287, potenciais candidatos a agentes inibidores da infecção por SARS-CoV-2, por meio da interação com a TMPRSS2, encorajando futuras investigações in vitro e in vivo para que os peptídeos aqui prospectados sejam utilizados como medicamentos específicos no tratamento da COVID-19 e de outras enfermidades.
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Proteins are multifunctional macromolecules and also act as sources of amino acids and energy. Protein hydrolysis also generates numerous bioactive peptides with different functions in the body. In this context, proteins are sources of biological products that can be used for the control and treatment of various human diseases, and may be candidates for the management and treatment of diseases such as COVID-19. To investigate experimental models that mimic human digestion and prospect peptides from trypsin inhibitor purified from tamarind (TTIp) seeds. The first two chapters of this study are referring to a systematic review (SR), and are organized as follows: the first chapter presents the SR protocol registered in the International Prospective Register of Systematic Reviews (under number CRD42020198709); and the second chapter is the SR of in vitro studies that used methodological procedures to mimic the gastrointestinal digestion of proteins. Articles were selected according to the study population, interventions, control, results and type of study strategy. The searches were carried out in Pubmed, Web of Science, Science direct, Embase, Virtual Health Library and Scopus databases. The methodological quality assessment was performed using the Office of Health Assessment and Translation tool. A total of 1.986 articles were selected, resulting in 20 eligible studies. In the results section, we describe the methodological procedures used in vitro to simulate the digestion of animal or vegetable proteins. The third chapter refers to an in silico prospecting study of native peptides and analogues with anti-SARS-Cov-2 potential, derived from TTIp. Native peptides were obtained from enzymatic cleavages of TTIp in silico and analogues were generated by replacing amino acids in the primary sequences of native peptides. The anti-SARS-CoV-2 potential was investigated by simulating molecular dynamics between the peptides and the binding sites of transmembrane serine protease 2 (TMPRSS2), necessary for the entry of SARS-CoV-2 into the host cell, and generated a patent application: BR 10 2022 020330 0. The best interaction potential energy occurred between TMPRSS2 and one of the native peptides obtained by cleavage with trypsin (-287.48 kJ.mol-1) and its analogue peptide (-293.49 kJ.mol-1). Thus, both peptides had many hydrophobic residues, a common physical-chemical property among peptides that inhibit the entry of enveloped viruses, such as SARS-Cov-2, present in drugs used to treat of diseases related to these enveloped viruses. Therefore, this research presents an expressive scientific contribution, since the SR grouped important data that will provide subsidies for development of studies related to the clinical application of bioactive peptides, concluding that, although in vitro dynamic experimental models are more accurate, static models can be used to simulate human proteolytic digestion, provided that the physiological conditions are controlled and there is a comparison with in vivo studies to ensure greater accuracy of the results. In addition, the in silico study resulted, from the cleavage of TTIp 56/287, in potential candidates for agents that inhibit SARS-CoV-2 infection, through interaction with TMPRSS2, encouraging future in vitro and in vivo investigations that aim to use the peptides prospected here as specific medicines for the treatment of COVID-19 and other diseases.
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FRANCISCO CARLOS DA SILVA JUNIOR
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A LOOK BEYOND THE PARTICULATE MATTER AND PRIORITY POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS (PAHs): A COMPREHENSIVE INVESTIGATION OF THE TOXICITY OF RETENE
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Orientador : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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MEMBROS DA BANCA :
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SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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VIVIANE SOUZA DO AMARAL
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FABIANO PERES MENEZES
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JULIANA DA SILVA
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RENATA CANALLE
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Data: 07/02/2023
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O material particulado (PM) é considerado uma das maiores ameaças à saúde humana em todo o mundo, no entanto, ainda há incertezas significativas e lacunas de conhecimento em relação a muitos dos produtos químicos responsáveis por esses efeitos, como os HPAs. Os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) são uma ampla classe de compostos químicos com significativo potencial mutagênico e carcinogênico, prejudicando assim o bem-estar do ser humano. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos inclui 16 HPAs prioritários nas avaliações de risco e analises de rotina ambiental. O reteno (1-metil-7-isopropilfenantreno; RET), um HPA não-prioritário, é um dos HPAs mais amplamente produzidos após incêndios florestais. Atualmente, os endpoints tóxicos do RET permanecem incertos, especialmente focando na saúde humana. Portanto, dividido em cinco capítulos, o objetivo deste trabalho foi investigar de forma abrangente os endpoints tóxicos do RET. No primeiro capítulo, por meio de uma revisão sistemática e meta-análise, foi demonstrada a presença de associação entre exposição ao PM e instabilidade genética em diferentes populações humanas, sendo que esse dano precoce pode levar à suscetibilidade a doenças complexas, inclusive o câncer de pulmão. No segundo capítulo, foi demonstrado que grande parte do conhecimento sobre os HPAs se restringe aos prioritários; entretanto, existem outros HPAs não prioritários no meio ambiente, cujos potenciais mutagênicos e carcinogênicos são subestimados nas avaliações de risco e análises de rotina ambiental, incluindo o RET. No terceiro capítulo, usando células de pulmão humano (A549), os resultados revelaram que o RET pode diminuir significativamente a viabilidade celular, bem como aumentar o potencial de membrana mitocondrial e o conteúdo mitocondrial, levando a um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). Além disso, RET levou a um aumento significativo na frequência de mutações cromossômicas, como micronúcleos (MN), pontes nucleoplásmicas (PNs) e brotos nucleares (BNs) mas não mutagenicidade em cepas de Salmonella; além de morte celular, principalmente por necrose. O quarto capítulo mostrou, usando análise in-silico de genes diferencialmente expressos, redes de interação e análise do perfil transcricional em células A549, que RET induziu variações em vários genes relacionados ao metabolismo, transcrição e controle traducional, estresse oxidativo, ciclo celular, replicação e reparo do DNA. Os genes envolvidos nesses processos podem explicar os fenótipos tóxicos demonstrados pela análise in sílico tais como genotoxicidade, mutagenicidade e carcinogenicidade. No quinto capítulo, usando o zebrafish (Danio rerio) como modelo experimental, RET induziu aumento na frequência de micronúcleos em eritrócitos e forneceu novas evidências sugerindo alterações comportamentais devido a mudanças no estado redox e na expressão de RNAm dos sistemas neurotransmissores em cérebros de zebrafish. No geral, esses resultados reforçam a necessidade de olhar além da prioridade em pesquisa toxicológica sobre HPAs, especialmente aqueles cujos potenciais tóxicos permanecem subestimados, como o RET, destacando a importância de incluir este HPA nas avaliações de risco e análises ambientais de rotina no futuro devido a todos os efeitos tóxicos potenciais em humanos.
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Particulate matter (PM) is considered one of the greatest threats to human health worldwide, there is still significant uncertainty and knowledge gaps with regard to many of the chemicals responsible for these effects such as PAHs. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) are a wide class of chemical compounds with significant mutagenic and carcinogenic potentials, thereby harming human well-being. The United States – Environmental Protection Agency (US-EPA) includes 16 priority PAHs in risk assessment or routine environmental analyses. Retene (1-methyl-7-isopropylphenanthrene; RET), a non-priority PAH, is one of the most widely produced PAHs following forest fires. At present, the toxic endpoints of RET remain unknown, especially in human health. Therefore, divided into five chapters, this work comprehensively investigated the toxic endpoints of RET. In the first chapter, through a systematic review and meta-analysis, it was demonstrated the presence of an association between exposure to PM and genetic instability in different human population, which this early damage may lead to susceptibility to complex diseases, including lung cancer. The second chapter demonstrated that much of the knowledge on the PAHs is restricted to the priority ones; however, there are other non-priority PAHs in the environment, whose mutagenic and carcinogenic potentials are underestimated in risk assessments and routine environmental analysis, especially RET. In the third chapter, using human lung cells (A549), the results revealed that RET can significantly decrease cell viability, increase oxidative stress, mitochondrial membrane potential, and mitochondrial contents, leading to an increased reactive oxygen species (ROS) production. Besides, RET led to a significant increase in chromosomal mutations such as micronuclei (MN), nucleoplasmic bridges (NPBs), and nuclear buds (NBUDs) frequency but not mutagenicity in Salmonella strains, as well as cell death, mainly due to necrosis. The fourth chapter showed, using in-silico analysis of differentially expressed genes (DEGs), interaction networks, and transcriptional profiles in A549 cells, that RET induced variations in several genes related to metabolism, transcriptional and translational control, oxidative stress, cell cycle, DNA replication, and repair. Genes involved in these processes may explain the toxic phenotypes demonstrated using the in-silico analyses such as genotoxicity, mutagenicity, and carcinogenicity. In the fifth chapter, using zebrafish (Danio rerio) as an experimental model, RET affected DNA generating micronuclei in erythrocytes and provided new evidence suggesting behavioral alterations due to changes in redox status and the mRNA expression of the neurotransmitter systems in zebrafish brains. Overall, these results reinforce the need to look beyond the priority in toxicological research on PAHs, especially those whose toxic potentials remain underestimated such as RET, highlighting the importance of including this PAH in risk assessments and routine environmental analysis in the future especially due its toxic effects in humans.
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LUCIANA FENTANES MOURA DE MELO
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EXTRATOS E FRAÇÕES DE Coccoloba alnifolia: POTENCIAL ANTIOXIDANTE, IMUNOMODULADOR E CICATRIZANTE in vitro
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Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
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MEMBROS DA BANCA :
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KATIA CASTANHO SCORTECCI
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RAFAEL BARROS GOMES DA CAMARA
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RIVA DE PAULA OLIVEIRA
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CARLOS HENRIQUE SALVINO GADELHA MENESES
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DEBORAH YARA ALVES CURSINO DOS SANTOS
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Data: 29/03/2023
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O estresse oxidativo é um desequilíbrio entre a produção das espécies reativas e os antioxidantes. O acúmulo de espécies reativas no organismo pode resultar em danos nos tecidos e órgãos, potencialmente induzindo a uma variedade de alterações fisiológicas que comprometem a homeostase e podem ser associadas a doenças cardíacas, neurológicas e câncer, por exemplo. Tem sido observado que compostos fenólicos derivados de plantas apresentam a capacidade de sequestrar e neutralizar os radicais livres em excesso. A espécie C. alnifolia, uma árvore da mata atlântica, apresenta poucos estudos etnobotânicos. Estudos anteriores do grupo mostraram que os extratos obtidos de folhas apresentaram um potencial antioxidante. Assim, neste trabalho, o objetivo foi avaliar o potencial antioxidante, imunomodulatório dos extratos etanólico (EE) e aquoso (EA) e de duas frações obtidas a partir do extrato aquoso (frações do acetato de etila (FA) e butanólica (FB)). Estas duas frações foram escolhidas a partir do perfil obtido após a análise em cromatografia líquida de alta performance, acoplada ao detector de diodo (CLAE-DAD). Estas duas frações foram caracterizadas por meio de ensaios in vitro quanto ao potencial antioxidante. Foi observado que ambas o possuem, entretanto, a FB, apresentou maior potencial antioxidante em relação à FA. Entre os resultados da atividade antioxidante obtidos, o que mais chamou a atenção foi a quelação de cobre, que não havia sido observada anteriormente no extrato bruto (EA). A partir destes resultados, foi avaliado o potencial imunomodulatório por meio de ensaios com a célula RAW 267.4. Primeiramente, foi verificado que tanto os extratos quanto as duas frações não foram citotóxicos. Em seguida, considerando a complexidade do processo inflamatório, foi analisado então o efeito de EE e de EA na produção de ROS após o tratamento com lipopolissacarídeo (LPS). Para isso, foram utilizadas três concentrações de extratos (100, 250 e 500 µg/mL). Verificou-se que ambos os extratos foram capazes de reduzir a produção de ROS quando comparados ao controle positivo (tratado com LPS). Além disso, a redução de ROS obtida com o EE foi semelhante ao controle negativo (sem o tratamento com LPS). Depois, foi verificada a capacidade dos extratos e das frações de inibir a produção de óxido nítrico (NO). Tanto os extratos como as frações foram capazes de inibir a produção e a liberação de NO nas três concentrações testadas, de forma dose-dependente, com redução maior que 50%. Ainda em relação aos extratos, foi avaliada a atividade fagocítica, pois essa é importante para a avaliação da atividade imunomoduladora. Essa análise foi realizada apenas com a concentração de 500 μg/mL, e verificou-se uma redução de 30% para EE e de 50% para EA. Considerando que as citocinas são importantes mediadores para a resposta imune e inflamatória, estas foram avaliadas utilizando duas metodologias, como a medição de citocinas por citometria de fluxo, em que houve aumento de IL-17 e de qRT-PCR, em que houve redução de iNOS e de IL-10, pelo EE. Com base nesses resultados, foi avaliado também o potencial dos extratos e das frações na migração celular utilizando a linhagem celular NHI/3T3 (fibroblastos) em culturas submetidas ao ensaio da ferida. Os resultados obtidos mostraram que ambos os extratos e frações, em 24 h, promoveram uma migração celular, tendo um fechamento em torno de 60% da ferida para os extratos, e em 75% para a fração FB, enquanto no controle (sem extrato), a porcentagem de migração celular foi em torno de 40%. Desse modo, os dados aqui apresentados demonstraram que os EE e EA e as frações FA e FB de C. alnifolia, possuem potencial antioxidante, imunomodulador, assim como apresentam a capacidade de induzir a migração celular envolvida no processo de cicatrização de feridas in vitro, propriedades importantes para extratos e frações com potencial para atuar na dinâmica do processo inflamatório e de dano tecidual. Com isso, conclui-se que tanto os extratos quanto as frações possuem potenciais aplicações futuras para biotecnologia em saúde.
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Oxidative stress is an imbalance between the production of reactive species and antioxidants. The accumulation of reactive species can result in damage to tissues and organs, and it can induce various physiological changes that compromise cellular homeostasis. This imbalance can be associated with diseases such as cardiac, neurological, and cancer. It has been observed that plants' phenolic compounds can scavenge and neutralize the excess of free radicals. C. alnifolia, the plant that is the focus of our research, is a tree from the Atlantic Forest and is known to have few ethnobotanical studies. Previous studies by our group have shown that extracts obtained from the leaves of this plant have antioxidant potential. Thus, in this work, the aim was to evaluate the antioxidant and immunomodulatory potential of the ethanolic extract (EE), aqueous extract (AE), and two fractions obtained from the aqueous extract – the ethyl acetate (AF) and butanolic (BF). These two fractions were chosen based on the profile obtained after analysis in high-performance liquid chromatography coupled to a diode detector (HPLC-DAD). In addition, these fractions were characterized here for their antioxidant potential by using in vitro assays. It was observed that both have antioxidant potential. The FB, however, displayed higher antioxidant potential compared to the FA. Within the antioxidant activity, the results obtained pointed out the chelation of copper, which had not been observed previously in the crude extract (EA). From these results, the immunomodulatory potential was evaluated through assays with the RAW 267.4 cell. First, it was verified that both the extracts and the two fractions were not cytotoxic. Then, considering the complexity of the inflammatory process, the effect of EE and EA on the production of ROS after treatment with lipopolysaccharide (LPS) was analyzed. For this, three concentrations of extracts were used (100, 250, and 500 µg/mL). Both extracts were found to be able to reduce ROS production when compared to the positive control (treated with LPS). Furthermore, the ROS reduction achieved with EE was similar to the negative control (without LPS treatment). Next, the ability of the extracts and fractions to inhibit nitric oxide production was verified. Both the extracts and the fractions were able to inhibit the production and release of NO at the three concentrations tested, in a dose-dependent manner, with a reduction of more than 50%. Moreover, the phagocytic activity was evaluated only for EE and AE. This analysis was done only at a concentration of 500 μg/mL, and a reduction in phagocytosis of 30% for EE and 50% for EA was observed. Considering that cytokines are important mediators for the immune and inflammatory response, they were evaluated using two methods such as the measurement of cytokines by flow cytometry, where there was observed an increase in IL-17, and by qRT-PCR, where there was a reduction in iNOS and IL -10 mRNA in the treatment with EE. Based on these results, the potential of extracts and fractions in cell migration was also evaluated using the NHI/3T3 cell line (fibroblasts) in cultures submitted to the wound assay. The results obtained showed that both extracts and fractions in 24 h promoted cell migration, with 60% wound closure for the extracts, and 75% for the FB fraction, while the control (no extract) migration percentage was around 40%. Therefore, the data presented here show that the EE and EA and the FA and FB fractions of C. alnifolia have antioxidant and immunomodulatory potential, as well as the ability to induce cell migration involved in the in vitro wound healing process. Besides, it was evidenced in this study important properties of extracts and fractions that have the potential to act on the dynamics of the inflammatory process and tissue damage. Consequently, both extracts and fractions have potential applications for health biotechnology.
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ANA CAMILA CAMPELO DE ALBUQUERQUE NUNES
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OS EFEITOS INDISCRIMINADOS DOS ESTEROIDES ANABOLIZANTES ANDROGÊNICOS NO SISTEMA CARDIOVASCULAR E SUA ANÁLISE POR BIOQUÍMICA QUÂNTICA
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Orientador : UMBERTO LAINO FULCO
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MEMBROS DA BANCA :
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UMBERTO LAINO FULCO
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EDILSON DANTAS DA SILVA JUNIOR
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EUDENILSON LINS DE ALBUQUERQUE
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JONAS IVAN NOBRE OLIVEIRA
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LUIZ ANTONIO RIBEIRO JUNIOR
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VALDER NOGUEIRA FREIRE
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Data: 25/05/2023
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Os esteroides androgênicos anabolizantes (AAS), derivados naturais e sintéticos da testosterona, são substâncias com características tanto androgênica como anabólica, que são utilizados tanto de forma clínica como também por atletas por suas propriedades anabólicas. No entanto, se questiona os efeitos anabólicos da testosterona e seus derivados, pois o que se sabe é que eles são eficazes para aumentar o desempenho e melhorar a aparência física, mesmo tendo efeitos colaterais que podem impactar sobre a saúde e o bem-estar. Esta tese apresenta duas pesquisas realizadas, uma relacionada a uma revisão narrativa e a segunda no campo da simulação ab initio, baseadas em princípios da Mecânica Quântica. O primeiro estudo expõe uma revisão narrativa através de estudos experimentais apontando os principais efeitos dos esteroides anabólicos androgênicos no sistema cardiovascular. Os artigos utilizados para esta revisão foram publicados no período de 2010 a 2019 nas bases de dados Pubmed, Scielo e em periódicos independentes, após a triagem por título e resumo, 26 artigos foram selecionados. Os resultados desta revisão permitiram ratificar que o uso de esteroides anabolizantes pode causar alterações estruturais e funcionais da musculatura cardíaca decorrente ao seu uso, por efeitos diretos e/ou indiretos, podendo provocar e perpetuar doenças cardiovasculares. O segundo estudo caracteriza o sítio de ligação dos AAS Testosterona, DHT e THG em complexo com o receptor androgênico identificando as interações químicas responsáveis pela manutenção da complementariedade fármaco-receptor e avalia as mudanças que ocorrem nessas interações, utilizando a estratégia MFCC à luz do DFT e parametrizações de constantes dielétricas. Nossos resultados confirmam a importância dos resíduos de aminoácidos Asn 705, Leu707, Leu704, Leu701, Leu873, Met742, Met780, Phe764, Met745 e Thr877 para o esteroide DHT. Quando analisamos o THG, os resíduos importantes foram Arg752, Asn705, Leu873, Leu707, Leu704, Met745, Met742 e Phe764. Já para o esteroide Testosterona os resultados confirmam a importância dos resíduos de 15 aminoácidos Asn705, Gly708, Leu704, Leu701, Leu873, Met745, Met742 Met895, Met780, Phe764, Phe876, Thr877. O método computacional utilizado no segundo estudo emerge como uma alternativa eficiente para o desenvolvimento de medicamentos e podem auxiliar na descoberta e design de ligantes antiandrogênicos aprimorados com ação aprimorada.
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Anabolic androgenic steroids (AAS), natural and synthetic derivatives of testosterone, are substances with both androgenic and anabolic characteristics, which are used both clinically and also by athletes for their anabolic properties. However, the anabolic effects of testosterone and its derivatives are questioned, as what is known is that they are effective in increasing performance and improving physical appearance, even with side effects that can impact health and well-being. This thesis presents two researches carried out, one related to a narrative review and the second in the field of ab initio simulation, based on principles of Quantum Mechanics. The first study exposes a narrative review through experimental studies pointing out the main effects of anabolic androgenic steroids on the cardiovascular system. The articles used for this review were published from 2010 to 2019 in the Pubmed and Scielo databases and in independent journals, after screening by title and abstract, 26 articles were selected. The results of this review confirmed that the use of anabolic steroids can cause structural and functional alterations in the cardiac musculature due to their use, through direct and/or indirect effects, which can cause and perpetuate cardiovascular diseases. The second study characterizes the binding site of AAS Testosterone, DHT and THG in complex with the androgen receptor, identifying the chemical interactions responsible for maintaining the drugreceptor complementarity and evaluating the changes that occur in these interactions, using the MFCC strategy in the light of the DFT and dielectric constant parameterizations. Our results confirm the importance of amino acid residues Asn 705, Leu707, Leu704, Leu701, Leu873, Met742, Met780, Phe764, Met745 and Thr877 for the DHT steroid. When we analyzed THG, the important residues were Arg752, Asn705, Leu873, Leu707, Leu704, Met745, Met742 and Phe764. As for the steroid Testosterone, the results confirm the importance of the amino acid residues Asn705, Gly708, Leu704, Leu701, Leu873, Met745, Met742 Met895, Met780, Phe764, Phe876, Thr877. 17 The computational method used in the second study emerges as an efficient alternative for drug development and can aid in the discovery and design of improved antiandrogen ligands with enhanced action.
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RAFAEL OLIVEIRA DE ARAÚJO COSTA
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Encapsulação de proteínas e peptídeos com propriedades anti-obesidade: estudo do efeito do inibidor de tripsina isolado de sementes de tamarindo na alteração de peso e saciedade
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Orientador : ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
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MEMBROS DA BANCA :
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ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
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ARNOBIO ANTONIO DA SILVA JUNIOR
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Catarina Gonçalves
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PRISCILLA VANESSA FINOTELLI
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SEVERINA CARLA VIEIRA CUNHA LIMA
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THAIS SOUZA PASSOS
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Data: 30/05/2023
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A obesidade impulsiona a busca por novas estratégias para combatê-la. Nesse sentido, vários peptídeos e proteínas com atividade sacietogênica têm sido alvos de estudos por agirem na regulação do consumo dietético e peso corporal. Dessa forma, esta tese divide-se em dois capítulos. No primeiro, buscou-se entender como peptídeos e proteínas, quando encapsuladas, atuavam sobre a saciedade, impactando no ganho de peso e no estado de obesidade. Para isso, foi realizada uma revisão integrativa por meio de busca em bases de dados, utilizando as palavras-chaves: peptídeo, proteína, obesidade, encapsulamento e agentes anti-obesidade e selecionando estudos pré-clínicos que comparavam o efeito de peptídeos ou proteínas, encapsulados ou não, sobre a saciedade. Foram selecionados 836 estudos, desses apenas quatro artigos atenderam os critérios de seleção. Embora tenha sido um número limitado de estudos, entre os efeitos observados com o encapsulamento dessas moléculas, destacaram-se a maior eficiência na redução do ganho de peso, alterações na função do tecido adiposo, além da redução dos níveis hormonais que modulam o apetite e o peso corporal, promovendo a potencialização dos efeitos desses peptídeos e proteínas quando encapsulados. No segundo capítulo, foi investigado o efeito do inibidor de tripsina isolado de sementes de tamarindo (ITT) comparado ao mesmo nanoencapsulado em quitosana e proteína isolada do soro do leite (EQPI). Dessa forma, o EQPI foi exposto a diferentes condições de pH (7.0; 3.0 e 7.0) e temperatura (37°C; 7°C e -18°C) visando avaliar a interação entre o ITT e os seus agentes encapsulantes monitorada pela atividade antitríptica. Posteriormente foi realizado o estudo pré-clínico, no qual ratos Wistar (n = 25), com obesidade induzida por dieta de alto índice glicêmico e alta carga glicêmica (HGLI) por 17 semanas, foram divididos em cinco grupos e avaliados por 10 dias, sendo eles: sem tratamento (HGLI + água), tratamento 1 (dieta nutricionalmente adequada), tratamento 2 (com dieta nutricionalmente adequada e EQPI/12,5 mg/kg), tratamento 3 (dieta HGLI e EQPI/12,5 mg/kg) e tratamento 4 (dieta HGLI e ITT/25 mg/kg). Esses grupos foram avaliados quanto ao consumo dietético, parâmetros zoométricos, bioquímicos e inflamatórios. O EQPI foi capaz de preservar eficientemente o ITT, não apresentando inibição para a tripsina, e quando submetido a condição ótima (agitação constante de 300 rpm, por aproximadamente 12 h, a 20°C) de liberação do ITT apresentou 100% de atividade antitríptica. Contudo, expondo EQPI aos diferentes pHs, apenas no pH gástrico durante 2 h observou-se expressiva atividade antitrípica. E quanto a exposição as temperaturas, EQPI apresentou alta atividade antitríptica, semelhante ao ITT (37°C por 4 h, 7°C por 3 dias e 7°C por 7 dias), demonstrando a liberação completa do ITT contido em EQPI. No estudo pré-clínico, ratos Wistar com obesidade tratados com EQPI reduziram significativamente a variação do peso corporal (p < 0,05) quando comparado ao tratamento com ITT. Observou-se que apenas o tratamento com ITT levou a mudanças significativas nos parâmetros inflamatórios (p < 0,05). O efeito do EQPI sobre o peso indica que a encapsulação promoveu aumento do efeito de ITT, com liberação sustentada. Portanto, a encapsulação de peptídeos e proteínas se mostra como uma estratégia promissora para aplicabilidade dessas moléculas no tratamento de doenças, como a obesidade.
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Obesity drives the search for new strategies to combat it. In this sense, several peptides and proteins with satietogenic activity have been studied because they regulate dietary intake and body weight. Thus, this thesis is divided into two chapters. First, we sought to understand how peptides and proteins, when encapsulated, acted on satiety, impacting weight gain and the state of obesity. For this, an integrative review was carried out by searching databases, using the keywords: peptide, protein, obesity, encapsulation, and anti-obesity agents, and selecting preclinical studies that compared the effect of peptides or proteins, encapsulated or not, on satiety. A total of 836 studies were selected, of which only four articles met the review's focus under the selection criteria. Although it has been a limited number of studies, among the effects observed with the encapsulation of these molecules are the greater efficiency in reducing weight gain, changes in the function of adipose tissue, in addition to the reduction of hormone levels that modulate appetite and body weight, promoting the potentiation of the effects of these peptides and proteins when encapsulated. In the second chapter, the impact of the trypsin inhibitor isolated from tamarind seeds (TTI) was investigated compared to the same one, nanoencapsulated in chitosan and isolated whey protein (EQPI). Thus, the ECW was analyzed and exposed to different pH conditions (7.0, 3.0, and 7.0) and temperatures (37°C, 7°C and -18°C) to evaluate the interaction between the TTI and its encapsulating agents monitored by antitrypsin activity. Subsequently, a preclinical study was carried out in which Wistar rats (n = 25) with obesity induced by a high glycemic index and high glycemic load (HGLI) diet for 17 weeks were divided into five groups and evaluated for ten days, with them: no treatment (HGLI + water), treatment 1 (nutritionally adequate diet), treatment 2 (with nutritionally adequate diet and ECW/12.5 mg/kg), treatment 3 (diet HGLI and ECW/12.5 mg/kg ) and treatment 4 (diet HGLI and TTI/25 mg/kg). These groups were evaluated for dietary intake, zoometric, biochemical, and inflammatory parameters. The ECW preserved the TTI, showing no inhibition for trypsin efficiently. When subjected to the optimal condition (constant stirring at 300 rpm, for approximately 12 h, at 20°C) for the release of the TTI, it showed 100% antitrypsin activity. However, exposing ECW to different pHs, significant anti-trips activity was observed only at gastric pH for 2 h. And regarding exposure to temperatures, ECW showed high antitrypsin activity, similar to TTI (37°C for 4 h, 7°C for three days, and 7°C for 7 days), demonstrating the complete release of TTI contained in ECW. In the preclinical study, obese Wistar rats treated with ECW significantly reduced body weight change (p < 0.05) compared to treatment with TTI. It was observed that only TTI treatment led to significant changes in inflammatory parameters (p < 0.05). The effect of ECW on weight indicates that encapsulation promoted an increase in the impact of TTI with sustained release. Therefore, the encapsulation of peptides and proteins is a promising strategy for the applicability of these molecules in the treatment of diseases such as obesity.
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CÁSSIO RICARDO DE MEDEIROS SOUZA
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ANTICORPOS ANTI-FLAVIVIRIDAE NAS SÍNDROMES DE GUILLAIN-BARRÉ E CONGÊNITA ASSOCIADA À INFECÇÃO PELO VÍRUS ZIKA
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Orientador : SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
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MEMBROS DA BANCA :
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ELIARDO GUIMARAES DA COSTA
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ERYVALDO SOCRATES TABOSA DO EGITO
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LUCAS PEDREIRA DE CARVALHO
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LUIZ BEZERRA DE CARVALHO JR
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SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
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Data: 09/10/2023
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Entre 2015 e 2016, o Brasil experimentou a maior epidemia de ZIKV já registrada até então, que se tornou problema de saúde pública não só pelo grande número de casos, mas principalmente pelo surgimento de outros quadros clínicos de maior gravidade associados à infecção, como a Síndrome de Guillain-Barré (SGB) e a Síndrome Congênita do ZIKV (SCZ). A avaliação da eficácia do diagnóstico sorológico e do perfil de resposta de anticorpos são duas grandes problemáticas no contexto da infecção por ZIKV. O diagnóstico sorológico é realizado principalmente através da detecção de anticorpos anti-NS1, mas há evidências de reatividade cruzada com outros flavivírus, prejudicando o diagnóstico específico da infecção por ZIKV. É de grande importância também o estudo da resposta e cinética de anticorpos anti-ZIKV pós infecção, a fim de determinar a existência de resposta de longo prazo e sua capacidade protetora. Essa tese, portanto, se debruça sobre essas duas problemáticas. Inicialmente, avaliou-se a eficácia da sorologia baseada em NS1 para detecção de IgM, IgG total e IgG3 anti-ZIKV e anti-DENV, e sua aplicação no diagnóstico diferencial da infecção prévia por ZIKV em casos de SGB. Observou-se a presença de anticorpos anti-ZIKV e anti-DENV em pacientes que desenvolveram SGB, avaliados entre 2009 e 2018 residentes de área endêmica para DENV. A presença desses anticorpos em indivíduos que desenvolveram a síndrome anteriormente à introdução do ZIKV no território é um indicativo da ocorrência de reatividade cruzada entre anticorpos anti-flaviviridae. Os achados indicam que a sorologia para detecção de IgM e IgG total anti-NS1, apesar de apresentarem sensibilidade considerável, não possuem especificidade suficiente para possibilitar o diagnóstico diferencial da infecção por ZIKV. Por sua vez, a sorologia para detecção de IgG3 anti-NS1 possui melhor performance, tornando possível a identificação de casos de SGB associados à infecção por ZIKV com maior eficácia. Em seguida, determinou-se a presença de anticorpos anti-NS1 e anti-E contra ZIKV e/ou DENV, bem como a presença de anticorpos neutralizantes anti-ZIKV, em mulheres que deram à luz crianças com SCZ avaliadas em dois períodos distintos, entre 8 e 24 meses pós-parto e entre 25 e 44 meses pós-parto, a fim de identificar se há resposta de anticorpos protetores de longo prazo. Os resultados indicam presença significativa de anticorpos anti-NS1 e anti-E, bem como de anticorpos neutralizantes anti-ZIKV, em mulheres avaliadas entre 8 e 24 meses pós-parto, interpretados aqui como sinal importante de exposição prévia a ZIKV. No segundo grupo, não foi possível identificar presença significativa de anticorpos anti-NS1 e anti-E, sugerindo decaimento dessa resposta ao longo do tempo. Entretanto, registrou-se presença significativa de anticorpos neutralizantes no soro nessas mulheres. Determinou-se que a atividade neutralizante contra ZIKV está relacionada à presença de anticorpos anti-ZIKV no primeiro grupo e, no segundo, esse fenômeno se correlaciona com a presença de anticorpos anti-DENV, sugerindo possível proteção cruzada entre anticorpos anti-ZIKV e anti-DENV. Estudos mais aprofundados são necessários para uma melhor caracterização do papel de anticorpos IgG3 como marcadores específicos de infecção recente por ZIKV, bem como o papel de anticorpos anti-NS1 e anti-E de longa duração como indutores de atividade neutralizante anti-ZIKV, a fim de prover melhores estratégias para o diagnóstico sorológico específico da infecção e um melhor entendimento da cinética e papel protetor de anticorpos anti-ZIKV.
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Between 2015 and 2016, Brazil has experienced the major ZIKV epidemics registered until now, which became a public health problem not only because the great number of cases, but mainly by the onset of critical infection-associated clinical conditions, like Guillain-Barré (GBS) and Congenital Zika Syndromes (CZS). The evaluation of serological diagnosis efficacy and antibody response profile are two great issues in ZIKV infection context. Serological diagnosis is mainly performed by detection of anti-NS1 antibodies, but there is evidence about cross-reactivity with antibodies against other flaviviruses, which impairs the ZIKV infection specific diagnosis. Also, urge the importance of study anti-ZIKV antibodies response and kinetics post-infection, to determine the existence of long-term antibodies and its protective capacity. So, the present work focuses in these two issues. First, efficacy NS1-based serology to detection of IgM, total IgG and IgG3 anti-ZIKV and anti-DENV and the application in differential diagnosis of ZIKV infection in SGB was evaluated. The presence of anti-ZIKV and anti-DENV antibodies in patients who developed GBS between 2009 and 2018, residents of DENV endemic area, was registered. The presence of these antibodies in individuals who developed the syndrome before ZIKV introduction indicates the occurrence of cross-reactivity between anti-flaviviridae antibodies. Data indicates IgM and total IgG serology, besides considerable sensitivity, do not present specificity enough to supports differential diagnosis of ZIKV infection. However, anti-NS1 IgG3 serology shows better performance, making possible the identification of ZIKV-associated GBS cases with more efficacy. Next, the presence of anti-NS1, anti-E and neutralizing antibodies against ZIKV and/or DENV, was determined in woman who gave birth children with CZS, evaluated in two distinct periods, 8-24 months post-partum and 25-44 months post-partum, to identify the occurrence of long-term protective antibody response. The results indicate significant presence of anti-NS1, anti-E and neutralizing antibodies in woman evaluated between 8- and 24-months post-partum, as an important sign of previous ZIKV exposition. IN the second group, it was not possible to identify significant presence of anti-NS1 and anti-E antibodies, suggesting time-associated decay of the response. However, the presence of neutralizing antibodies was registered. Anti-ZIKV neutralizing response are related to presence of anti-ZIKV antibodies in first group and, int the second one, this phenomenon was associated with the occurrence of anti-DENV antibodies, suggesting cross-protective activity between anti-ZIKV and anti-DENV antibodies. It is necessary more studies to a better characterization of IgG3 role as specific markers of ZIKV infection, and long-term anti-NS1 and anti-E as anti-ZIKV neutralizing antibodies, to improve serological diagnosis strategies and enforces the knowledge about kinetics and protective role of anti-ZIKV antibodies.
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JOHNY WYSLLAS DE FREITAS OLIVEIRA
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CARACTERIZAÇÃO DO DIETILDITIOCARBAMATO DE SÓDIO COMO POTENCIAL FÁRMACO PARA TRATAMENTO DA DOENÇA DE CHAGAS
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Orientador : MARCELO DE SOUSA DA SILVA
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MEMBROS DA BANCA :
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ALINE RIMOLDI RIBEIRO
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ARNOBIO ANTONIO DA SILVA JUNIOR
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CLAUDIA JASSICA GONÇALVES MORENO
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HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
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MARCELO DE SOUSA DA SILVA
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Data: 19/10/2023
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A doença de Chagas é uma zoonose endêmica na America Latina e afetam principalmente as populações mais pobres. Os medicamentos disponíveis para tratar ambas as doenças apresentam baixa efetividade frente as formas intracelulares, elevada toxicidade, baixa biodisponibilidade e acabam por não serem seguras a saúde dos pacientes. Portanto, a várias décadas busca-se avaliar a possibilidade na utilização de outros medicamentos frente a esta doença. Um promissor candidato é o dietilditiocarbamato de sódio (DETC) já descrito como sendo um composto de alta eficácia frente Leishmania sp. e ao Trypanosoma cruzi em modelos in vitro e in vivo, todavia, buscando implementar sua biodisponibilidade e reduzir também qualquer possibilidade de toxicidade foi avaliado neste trabalho emprego de um nanosistema juntamente testado com o DETC em uma abordagem in vitro, in silico e in vivo frente ao Trypanosoma cruzi. Para tal a nanopartícula foi nanoformulada por nanoprecipitação utilizando PLA como polímero e testada em modelos in vitro para caracterização físico-química, citotoxicidade, penetração celular e atividade antiparasitária, ao qual observou-se que o nanosistema após a nanoformulação PLA-DETC mostrou-se estável, com tamanho médio < 200nm e com IPD <0,3 e potencial zeta de -20 mV, demonstrou baixa toxicidade celular não provocando redução menores do 20% da viabilidade celular, capacidade de penetrar as células 3T3 e RAW em um sistema in vitro em 24 horas e também chegou a inibir quase 70% da cepa Dm28c de T. cruzi em 24 horas. Bem como observou-se ser capaz de induzir o aumento de espécies reativas de oxigênio no interior dos parasitas em quase 70%, sendo este um importante fator que pode levar o parasita a morte. Além disso, a partir de uma abordagem in sílico foi observado que o DETC apresentava um perfil ADMET mais adequado com base nas propriedades físico-químicas e químicas medicinais quando comparados com os fármacos tradicionalmente utilizados frente a doença de Chagas, o que indica uma menor toxicidade. Além disso, verificou-se a toxicidade in vivo tanto da nanopartícula de PLA-DETC, bem como o fármaco livre nas concentrações 300mg/kg e 1000mg/kg, ao qual avaliaram-se os perfis hematológicos, bioquímicos, histopatológicos e parâmetros físicos frente a caracterização da toxicidade aguda preconizada pela OECD no teste 423. A partir dos resultados foi observada pouquíssimas alterações em comparação com o grupo controle, primeiramente foi observada uma redução de 10% nos níveis de plaquetas, um leve aumento da ureia e o AST, com uma redução dos níveis de creatina, além disso, não houve alteração significativa no peso dos animais que seguiram o mesmo padrão que o grupo controle, bem como não foi observada mudança nos comportamentos dos animais. Por fim, foram avaliados protocolos de infecção e tratamento utilizando o DETC (300 mg/kg, 100 mg/kg, 0,36mg e 0,18 mg) e da nanopartícula de PLA-DETC (0,36mg e 0,18mg), ao qual observou-se redução significativamente estatística para o DETC que apresentou perfil similar ao benzonidazol na concentração de 100 mg/kg. Além disso, notou-se que durante o tratamento de 7 dias poucas alterações foram promovidas, resultando em uma baixa toxicidade do composto.
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Chagas disease is an endemic zoonosis in Latin America, mainly affecting the poorer populations. The available drugs for treating both diseases have low effectiveness against intracellular forms, high toxicity, low bioavailability, and end up being unsafe for patients' health. Therefore, for several decades, efforts have been made to evaluate the possibility of using other drugs to combat this disease. One promising candidate is sodium diethyldithiocarbamate (DETC), previously described as a highly effective compound against Leishmania sp. and Trypanosoma cruzi in in vitro and in vivo models. However, in an attempt to enhance its bioavailability and reduce potential toxicity, this study evaluated the use of a nanosystem in combination with DETC through in vitro, in silico, and in vivo approaches against Trypanosoma cruzi. n this study, the nanoparticle was nanoformulated through nanoprecipitation using PLA as a polymer and tested in vitro for physicochemical characterization, cytotoxicity, cellular penetration, and antiparasitic activity. The nanoformulated PLA-DETC was found to be stable, with an average size of <200 nm and with IPD <0.3 and a zeta potential of -20 mV. It exhibited low cellular toxicity, causing no reduction of more than 20% in cell viability, had the ability to penetrate 3T3 and RAW cells within a 24-hour period, and also inhibited almost 70% of the Dm28c strain of T. cruzi within 24 hours. Additionally, it was observed that the nanosystem was capable of inducing an almost 70% increase in reactive oxygen species inside the parasites, which is a crucial factor that can lead to the parasite's death.Furthermore, an in silico analysis revealed that DETC had a more suitable ADMET profile based on physicochemical and medicinal chemistry properties compared to traditionally used drugs against Chagas disease, indicating lower toxicity. In vivo toxicity of both PLA-DETC nanoparticles and free drug at concentrations of 300 mg/kg and 1000 mg/kg was evaluated, considering hematological, biochemical, histopathological, and physical parameters following the acute toxicity characterization recommended by OECD in test 423. The results showed minimal alterations compared to the control group. A 10% reduction in platelet levels was observed, along with a slight increase in urea and AST, and a decrease in creatinine levels. Moreover, there were no significant changes in the animals' weight, behavior, or physical parameters, aligning with the control group. Finally, infection and treatment protocols were evaluated using DETC (300 mg/kg, 100 mg/kg, 0.36 mg, and 0.18 mg) and PLA-DETC nanoparticles (0.36 mg and 0.18 mg). A statistically significant reduction was observed for DETC, which exhibited a profile similar to benznidazole at a concentration of 100 mg/kg. Additionally, during the 7-day treatment, few alterations were observed, indicating low compound toxicity.
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MARIA LÚCIA DA SILVA CORDEIRO
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EXTRATOS DE Talisia esculenta APRESENTAM COMPOSTOS BIOATIVOS COM ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO EM MODELOS IN VITRO E IN VIVO
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Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
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MEMBROS DA BANCA :
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ADRIANA FERREIRA UCHOA
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DAYANNE LOPES GOMES
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DEBORAH YARA ALVES CURSINO DOS SANTOS
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KATIA CASTANHO SCORTECCI
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RAFAEL BARROS GOMES DA CAMARA
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Data: 24/10/2023
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Conhecida popularmente como Pitombeira, Talisia esculenta (Sapindaceae) é uma espécie nativa do nordeste brasileiro que possui potencial econômico e medicinal. Os frutos desta planta são utilizados na alimentação e suas cascas atualmente têm seu potencial farmacológico pouco explorado, sendo descartado sem nenhuma aplicação biotecnológica A infusão de suas folhas é utilizada na medicina popular com indicação contra dores no quadril, reumatismo e pressão alta, porém, até o momento estudos de avaliação de seu potencial farmacológico, toxicológico e composição fitoquímica são escassos. Diante desse contexto, esse estudo teve como objetivo obter os extratos hidroetanólicos e as infusões das folhas e cascas dos frutos de T. esculenta, realizar sua caracterização fitoquímica, mensurar seu potencial antioxidante e anti-inflamatório in vitro e sua toxicidade e capacidade antioxidante in vivo, utilizando dois modelos animais, Tenebrio molitor e Zebrafish. Para isso, foram preparados o extrato hidroetanólico (70%) e o extrato aquoso (infusão) a partir das folhas frescas e cascas dos frutos da espécie, obtendo-se assim o extrato hidroetanólico das folhas (HF), infusão das folhas (IF), extrato hidroetanólico das cascas dos frutos (HC) e infusão das cascas dos frutos (IC). Inicialmente, a avaliação da capacidade antioxidante foi realizada por meio dos ensaios de Capacidade Antioxidante Total (CAT), sequestro do radical DPPH, poder redutor e quelação de Cobre. A citotoxicidade dos extratos foi avaliada por meio do ensaio MTT e ensaio de migração, e mensurada sua capacidade antioxidante em células NHI/3T3. Os extratos IF e HC foram selecionados para ter seus efeitos investigados em T. molitor e para caracterização fitoquímica, que foi realizada por meio da quantificação do teor de fenolicos, flavonoides e análise por CLAE-DAD (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por arranjo de diodos). Também foi analizado nesse trabalho, o potencial antioxidante e anti-inflamatório de todos os extratos de T. esculenta sobre a linhagem de macrófagos RAW 264.7. Ademais, investigou-se os efeitos protetores dos extratos de T. esculenta com os modelos de estresse oxidativo induzido por H2O2 e CuSO4 e ascorbato em Zebrafish, com base na análise dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO). Os resultados revelaram que ambos os extratos apresentaram capacidade de sequestro de radicais, assim como uma elevada capacidade de quelação de íons cobre. Observou-se que os extratos de T. esculenta não apresentaram efeitos citotóxicos sobre a linhagem NHI/3T3, e apresentaram efeitos protetores contra o dano oxidativo induzido por CuSO4 e ascorbato. A análise da sobrevivência em larvas de T. molitor mostrou que IF e HC não apresentaram toxicidade significativa, nas concentrações avaliadas e foram capazes de reduzir o efeito do CuSO4 sobre os animais, uma vez que foi verificado uma maior sobrevivência de larvas tratadas com os extratos, com relação ao controle positivo, bem como menor melanização nos animais. A análise por CLAE-DAD revelou a presença de compostos em sua maioria da classe dos flavonoides, e identificou-se a presença de ácido gálico, quercitrina e rutina. Os resultados com modelo celular RAW 264.7 demonstraram a ausência de citotoxicidade pelo ensaio MTT e que os extratos de T. esculenta também foram capazes de reduzir os danos causados pelo estresse oxidativo induzido por H2O2 nos macrófagos. No entanto, apenas HC foi capaz de reduzir a produção de óxido nítrico (NO), quando os macrófagos foram estimulados com Lipopolissacarídeo (LPS). Todos os extratos reduziram os níveis de ERO nas larvas de Zebrafish expostas ao H2O2, no entanto uma redução mais significativa foi verificada para HF, IF e HC que foram iguais estatisticamente ao controle negativo. Ambos as amostras também reduziram os níveis de ERO no modelo de estresse induzido por CuSO4 e ascorbato em Zebrafish, de forma elevada. Em conjunto, esses dados demonstram que T. esculenta é uma fonte de compostos com potentes efeitos antioxidantes e potencial anti-inflamatório que deve ser mais profundamente estudado para futuras aplicações biotecnológicas.
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Commonly referred to as Pitombeira, Talisia esculenta (Sapindaceae) is an indigenous species endemic to Northeastern Brazil with significant economic and medicinal promise. While the fruit of this plant serves as a food source, its rind remains largely underutilized in pharmacological applications and is often discarded without further biotechnological exploration. Traditional folk medicine employs leaf infusions from T. esculenta as remedies for hip pain, rheumatism, and hypertension. However, comprehensive studies evaluating its pharmacological efficacy, toxicological profile, and phytochemical constituents are notably limited. In this context, the aim of this study was to obtain hydroethanolic extracts and infusions of the leaves and fruit rinds of T. esculenta. Subsequently, it aims to perform its phytochemical characterization, measure its antioxidant and anti-inflammatory potential in vitro and its toxicity and antioxidant capacity in vivo. For this purpose, two animal models will be used, Tenebrio molitor and Zebrafish. The hydroethanolic extract (70%) and the aqueous extract (infusion) were prepared from the fresh leaves and fruit peels of the species, obtaining the hydroethanolic extract of the leaves (HF), infusion of the leaves (IF), hydroethanolic extract of the fruit peels (HC), and infusion of the fruit peels (IC). Firstly, the antioxidant capacity was assessed using various assays: Total Antioxidant Capacity (CAT), DPPH radical scavenging, reducing power, and copper chelation. Cytotoxicity was evaluated through the application of MTT and wound healing assays, while the antioxidant potential was quantified in NIH/3T3 cells. As the extracts IF and HC were selected for further investigation on their effects on T. molitor and phytochemical characterization by quantifying the content of phenolics and flavonoids and analyzing them by CLAE-DAD (High-Performance Liquid Chromatography with Diode-Array Detection). This work also analysed the antioxidant and anti-inflammatory potential of all the T. esculenta extracts on the RAW 264.7 (macrophage strain). In addition, the protective effects of T. esculenta extracts were investigated using models of oxidative stress induced by H2O2 and CuSO4 and ascorbate in zebrafish, based on the analysis of levels of reactive oxygen species (ROS). The assays indicated that both extract types exhibited effective radical scavenging capabilities and a high capacity for copper ion chelation. It was observed that T. esculenta extracts had no effects on MTT reduction or cell migration. Furthermore, these extracts protected cells from oxidative stress induced by both CuSO4 and ascorbate. Survival analysis revealed that IF and HC exhibited no significant toxicity at the evaluated concentrations. Moreover, these extracts mitigated the effects of CuSO4 exposure on T. molitor larvae. Specifically, an increase in larval survival was observed when treated with these extracts compared to the positive control. Additionally, a reduction in melanization was verified in the animals. The CLAE-DAD analyse revealed the presence of compounds mostly from the flavonoid class, and the presence of gallic acid, quercitrin and rutin was identified In RAW 264.7 cell assays, the extracts demonstrated no cytotoxicity as per MTT tests and effectively mitigated oxidative damage induced by H2O2 in macrophages. However, only HC was able to reduce nitric oxide (NO) production in LPS-stimulated macrophages. Moreover, the protective effects of T. esculenta extracts on H2O2 and CuSO4 and ascorbate-induced oxidative stress model in zebrafish were also investigated based on the analysis of ROS levels by fluorescence microscopy. All extracts reduced ROS levels in larvae exposed to H2O2, however a significant reduction was verified for HF, IF and HC, which were statistically equal to the negative control. All samples reduced ROS levels in the CuSO4 and ascorbate-induced stress model. Collectively, these findings suggest that T. esculenta is a promising source of bioactive compounds with potent antioxidant and anti-inflammatory properties, warranting further research for potential biotechnological applications.
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ARANTHYA HEVELLY DE LIMA COSTA
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Bioquímica Quântica de Interações Ligante-Proteína entre Potenciais
Agentes Anti Maláricos e as Enzimas DHODH e TyrRS do Plasmodium
falciparum
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Orientador : UMBERTO LAINO FULCO
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MEMBROS DA BANCA :
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UMBERTO LAINO FULCO
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EUDENILSON LINS DE ALBUQUERQUE
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JONAS IVAN NOBRE OLIVEIRA
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VANESSA DE PAULA SOARES RACHETTI
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EVELINE MATIAS BEZERRA
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RONER FERREIRA DA COSTA
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Data: 10/11/2023
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A malária é uma doença parasitária, originada de protozoários unicelulares que compõem o gênero Plasmodium, abrangendo mais de 90 países, sendo predominante nos continentes africano e asiático. O uso de medicamentos antimaláricos é crucial tanto para o tratamento quanto para a prevenção da doença. No entanto, os parasitas começaram a desenvolver resistência aos medicamentos antimaláricos, tornando as terapias atuais ineficazes ao combate do parasita. Como resultado, novas abordagens terapêuticas são necessárias para superar a resistência aos medicamentos nos parasitas e aumentar a eficácia da terapia medicamentosa contra a doença. O objetivo desta pesquisa é fornecer uma caracterização das inter-relações que interferem no comportamento dos complexos proteína-ligante de enzimas provenientes do Plasmodium falciparum. O primeiro estudo visa caracterizar a diidroorotato desidrogenase (DHODH), apresentando os valores energéticos da enzima nos complexos com a PfDHODH de tipo selvagem, com os ligantes DSM483, DSM557 e DSM1, e com PfDHODH com a mutação C276F, em conjunto com o DMS1. No segundo estudo, a pesquisa é realizada com a tirosina RNAt sintetase (TyrRS), sendo também estudada tanto na sua forma selvagem PfTyrRS, ligada ao ML901-Tyr e AMS-Tyr, quanto com a mutação S234C, novamente em complexo com o ML901-Tyr. Utilizando o método de fracionamento molecular com capas conjugadas (MFCC), os resíduos de aminoácidos foram particionados para calcular interações individuais com o formalismo DFT (Teoria da Densidade Funcional). O estudo com a enzima PfDHODH revelou que os resíduos de aminoácidos Arg265, Cys184 e Phe188 foram cruciais nas interações, e apresentaram energias de interação significativas com os quatro complexos estudados. Além disso, o valor energético do inibidor DSM1 não foi afetado pelas alterações estruturais causadas pela mutação C276F, demonstrando a sua capacidade de ligação à enzima. Já se tratando do trabalho envolvendo PfTyrRS, foram encontrados seis resíduos significativos compartilhados entre os três complexos. Esses resíduos incluem Asp61, Gln73, Gln192, Gln210, Met237 e Phe63, com a maioria deles desempenhando um papel essencial na ligação do ATP. Esta descoberta permite uma compreensão abrangente da interação entre as enzimas PfDHODH e PfTyrRS, juntamente com os seus inibidores. As informações coletadas neste estudo despontam como relevantes para o desenvolvimento de novas terapias medicamentosas, podendo vir a tornar-se um auxílio na exploração de design de novas drogas antimaláricas mais elaboradas e eficazes.
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Malaria is a parasitic disease caused by unicellular protozoa of the genus Plasmodium and occurs in more than 90 countries, with the African and Asian continents predominating. The use of antimalarial drugs is critical for both treatment and prevention of the disease. However, the parasites have begun to develop resistance to antimalarials, making current therapies ineffective in controlling the parasite. Therefore, new therapeutic approaches are needed to overcome the drug resistance of parasites and increase the efficacy of drug therapy against the disease. The aim of this research is to characterize the relationships that affect the behavior of protein-ligand complexes of enzymes from Plasmodium falciparum. The first study aims to characterize dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) and to present the energy levels of the enzyme in the complexes with wild-type PfDHODH, with ligands DSM483, DSM557, and DSM1, and with PfDHODH with the C276F mutation together with DMS1. In the second study, tyrosine RNAt synthetase (TyrRS) is examined, both in its wild-type PfTyrRS linked to ML901-Tyr and AMS-Tyr, and with the S234C mutation, again in complex with ML901-Tyr. Using the method of molecular fractionation with conjugated layers (MFCC), amino acid residues were partitioned to calculate individual interactions using the formalism DFT (Functional Density Theory). The study with PfDHODH enzyme revealed that amino acid residues Arg265, Cys184 and Phe188 were crucial for the interactions and exhibited significant interaction energies with the four complexes studied. Moreover, the energy value of the DSM1 inhibitor was not affected by the structural changes caused by the C276F mutation, demonstrating its ability to bind to the enzyme. Working with PfTyrRS, six important residues were found to be common to the three complexes. These residues include Asp61, Gln73, Gln192, Gln210, Met237, and Phe63, most of which play essential roles in ATP binding. This discovery provides a comprehensive understanding of the interaction between PfDHODH and PfTyrRS enzymes and their inhibitors. The information gathered in this study is proving to be relevant to the development of new drug therapies and could become a tool in exploring the design of new, more sophisticated and effective antimalarial drugs.
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PAULO EDUARDO TOSCANO SOARES
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Aplicação do sequenciamento de leituras curtas no estudo da variabilidade genômica de organismos relevantes para a carcinicultura
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Orientador : DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
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MEMBROS DA BANCA :
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DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
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RODRIGO JULIANI SIQUEIRA DALMOLIN
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TETSU SAKAMOTO
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JOSÉ MIGUEL ORTEGA
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SÁVIO TORRES DE FARIAS
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Data: 01/12/2023
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Nas últimas duas décadas, o sequenciamento de leituras curtas se tornou uma ferramenta central nos estudos genômicos permitindo a rápida e precisa descoberta de sequências de DNA em alta quantidade. Isso viabilizou a aplicação do sequenciamento em atividades de interesse econômico como a carcinicultura permitindo, por exemplo, a identificação de patógenos e a genotipagem, tanto de centenas a milhares de camarões simultaneamente quanto a detecção de variantes genéticas desses patógenos. Esse sequenciamento pode também auxiliar na descoberta de marcadores genéticos, como os microsatélites e SNPs, que podem ser reunidos em um painel de genotipagem, tornando escalável e reduzindo o custo por amostra da sua aplicação. Especificamente na carcinicultura, esta tecnologia tem se mostrado extremamente valiosa, principalmente para o estudo do genoma de camarões. As análises dos genomas nuclear e mitocondrial fornecem informações cruciais sobre origem, adaptabilidade e outros aspectos evolutivos que são vitais para a otimização da criação de camarões. Devido à alta profundidade de cobertura dos desses sequenciamentos, é possível capturar a diversidade genética nas amostras, permitindo descobrir variações genéticas em populações mitocondriais (heteroplasmia) ocorrendo nos camarões e nos patógenos, como os vírus que os acometem. Surge assim, uma oportunidade única de se estudar os impactos dessa diversidade genética no uso de marcadores mitocondriais e na descoberta de variantes e quasispécies virais. Isso se traduz em práticas de manejo mais informadas, minimizando surtos e otimizando a saúde dos camarões. Já a implementação de painéis baseados em SNPs é um claro exemplo do impacto da genotipagem, demonstrando como a tecnologia pode ser usada para melhorar as práticas de seleção genética em carcinicultura. Neste trabalho, avaliou-se o impacto da diversidade genética mitocondrial, em um vírus que acomete a carcinicultura e no camarão por abordagens de bioinformática. Primeiro, foram avaliadas a ocorrência de heteroplasmia analisando-se dados do sequenciamento do músculo de um único camarão, detectando padrões de variabilidade e conservação nos mitogenomas desse indivíduo, além de comparar essa variabilidade interna com a observada entre outros mitogenomas e observar o impacto em marcadores na região de controle, muito utilizada em estudos populacionais. Segundo, avaliou-se a variabilidade genética do vírus da mionecrose infecciosa do camarão obtido em tanques em situação de surto viral, obtendo-se o genótipo da variante mais prevalente para análises filogenéticas, revelando sua possível origem e relação com demais linhagens existentes, e de variantes secundárias, avaliando a ocorrência de quasispécies virais. Por último, a partir de dados previamente existentes, foi desenvolvido um painel de 25 marcadores de SNPs (15 genômicos e 10 mitocondriais) objetivando a genotipagem a baixo custo do camarão Penaeus vannamei por amplificação por PCR multiplex seguido de análises de parentesco in silico. Atualmente este último projeto encontra-se em andamento e já teve os iniciadores avaliados, restando agora seguir com o sequenciamento e as análises de bioinformática. Em suma, este trabalho mostrou que o sequenciamento de leituras curtas é capaz de capturar a diversidade genética, trazendo novas percepções para a carcinicultura ao expor o impacto em marcadores, a variabilidade viral e, futuramente, o impacto dessa variabilidade em painéis de genotipagem.
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Over the last two decades, short-read sequencing has become a central tool in genomic studies allowing the rapid and accurate discovery of high-quantity DNA sequences. This made it possible to apply sequencing in activities of economic interest such as shrimp farming, allowing, for example, the identification of pathogens and genotyping of hundreds to thousands of shrimps simultaneously and the detection of genetic variants of these pathogens. This sequencing can also help in the discovery of genetic markers, such as microsatellites and SNPs, which can be brought together in a genotyping panel, making it scalable and reducing the cost per sample of its application. Specifically in shrimp farming, this technology has proven to be extremely valuable, especially for studying the shrimp genome. Nuclear and mitochondrial genome analyzes provide crucial information about origin, adaptability and other evolutionary aspects that are vital for optimizing shrimp farming. Due to the high depth of coverage of these sequences, it is possible to capture genetic diversity in the samples, allowing the discovery of genetic variations in mitochondrial populations (heteroplasmy) occurring in shrimp and in pathogens, such as viruses that affect them. This presents a unique opportunity to study the impacts of this genetic diversity on the use of mitochondrial markers and the discovery of viral variants and quasispecies. This translates into more informed management practices, minimizing outbreaks and optimizing shrimp health. The implementation of panels based on SNPs is a clear example of the impact of genotyping, demonstrating how the technology can be used to improve genetic selection practices in shrimp farming. In this work, the impact of mitochondrial genetic diversity was evaluated in a virus that affects shrimp farming and shrimp using bioinformatics approaches. First, the occurrence of heteroplasmy was assessed by analyzing muscle sequencing data from a single shrimp, detecting patterns of variability and conservation in the mitogenomes of that individual, in addition to comparing this internal variability with that observed among other mitogenomes and observing the impact on markers in the control region, widely used in population studies. Second, the genetic variability of the shrimp infectious myonecrosis virus obtained from tanks in a viral outbreak situation was evaluated, obtaining the genotype of the most prevalent variant for phylogenetic analyses, revealing its possible origin and relationship with other existing lineages, and secondary variants, evaluating the occurrence of viral quasispecies. Finally, based on previously existing data, a panel of 25 SNP markers (15 genomic and 10 mitochondrial) was developed aiming at low-cost genotyping of the shrimp Penaeus vannamei by multiplex PCR amplification followed by silico parentage analysis. This last project is currently ongoing, and the primers have already been evaluated, and now it remains to continue with sequencing and bioinformatics analyses. In short, this work showed that short-read sequencing is capable of capturing genetic diversity, bringing new insights to shrimp farming by exposing the impact on markers, viral variability and, in the future, the impact of this variability on genotyping panels.
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BRUNO AMORIM DO CARMO
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ATIVIDADE IN VITRO E IN VIVO DE PEPTÍDEOS ANTIMICROBI-ANOSANÁLOGOS INCORPORADOS À NANOPARTÍCULAS DE PLGA CONTRA Staphylococcusaureus
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Orientador : MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
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MEMBROS DA BANCA :
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MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
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MARCELO DE SOUSA DA SILVA
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ARNOBIO ANTONIO DA SILVA JUNIOR
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ENEAS DE CARVALHO
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MARIANA DE SOUZA CASTRO
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Data: 07/12/2023
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O surgimento de microrganismos multirresistentes aos fármacos conven-cionais consiste em um grave problema de saúde pública mundial quelimita as alternativas terapêuticas e revela a necessidade da busca urgentepor novos agentes antimicrobianos. A peçonha do escorpião Tityus stig-murus é uma rica fonte de componentes biologicamente ativos, incluindopeptídeos antimicrobianos com elevado potencial terapêutico. A Stigmu-rina consiste em um peptídeo antimicrobiano, com efeito antibiótico sobrecepas bacterianas Gram-positivas. Utilizando este peptídeo nativo comoprotótipo foram realizadas modificações na estrutura primária da Stigmu-rina com o intuito de potencializar sua atividade, gerando 31 análogos(patente BR102015029044-6). Neste estudo, foi elucidada a conformaçãotridimensional por ressonância magnética nuclear (RMN), investigada aestabilidade por dicroísmo circular e avaliada a ação antibacteriana in vi-tro e in vivo de dois peptídeos análogos da Stigmurina denominados deStigA25 e StigA31. Além da notável atividade antimicrobiana já descritaem estudo anterior, os peptídeos StigA25 e StigA31 apresentaram açãohemolítica dependente de concentração em relação ao peptídeo protótipo.Afimdereduziracitotoxicidade,aumentaraestabilidadeepotencializara eficiência terapêutica desses peptídeos, foi investigado o efeito da asso-ciação desses componentes bioativos à nanopartículas de poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA). StigA25 e StigA31 revelaram uma confor-mação predominante em α-hélice por RMN,com elevadaestabilidadeestrutural em diferentes condições de temperatura, pH e na presença desais por dicroísmo circular. A associação destes componentes às nanopartículas de PLGA possibilitou um nanosistema estável com alto índice deincorporação dos peptídeos, atividade antimicrobiana equivalente aos dospeptídeos livres e relevante redução da toxicidade. A microscopia eletrô-nica de varredura e transmissão demonstrou que tanto os peptídeos livresquanto nanoparticulados apresentam ação na membrana celular bacteriana,promovendoarupturadamembrana.Portanto,esteestudorevelao elevado potencial terapêutico do StigA25 e StigA31 associados a nanosis-tema de PLGA, indicando o uso deste nanocarreador como uma ferramenta promissora para a aplicação terapêutica destas moléculas bioativas nodesenvolvimentodenovos agentes anti-infecciosos.
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The emergence of microorganisms resistant to conventional drugs consti-tutesaseriousglobalpublichealthissuethatlimitstherapeuticoptionsand underscores the urgent need for the discovery of new antimicrobialagents.ThevenomofthescorpionTityusstigmurusservesasarichsource of biologically active components, including antimicrobial peptideswith high therapeutic potential. Stigmurin, an antimicrobial peptide withantibiotic activity against Gram-positive bacterial strains, was used as aprototype for structural modifications, resulting in the generation of 31analogs (patent BR102015029044-6). In this study, the three-dimensionalconformation was elucidated using nuclear magnetic resonance (NMR),stability was investigated through circular dichroism, and the in vitro andin vivo antibacterial action of two analog peptides of Stigmurin, namedStigA25 and StigA31, was assessed. In addition to the remarkable antimi-crobial activity described in a previous study, StigA25 and StigA31 exhib-ited concentration-dependent hemolytic activity compared to the proto-type peptide. To mitigate cytotoxicity, enhance stability, and optimizetherapeutic efficiency of these peptides, the effect of associating thesebioactive components with poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanopar-ticles was investigated. StigA25 and StigA31 displayed a predominant α-helical conformation by NMR, with high structural stability under varioustemperature, pH, and salt conditions as determined by circular dichroism.The incorporation of these components into PLGA nanoparticles resultedinastablenanosystemwithantimicrobialactivityequivalenttothatoffree peptides and a significant reduction in toxicity. Scanning and trans-mission electron microscopy demonstrated that both free and nanoparticulated peptides exerted their action on the bacterial cell membrane, causingmembrane disruption. Therefore, this study reveals the high therapeuticpotential of StigA25 and StigA31 when associated with PLGA nanosystems, suggesting the use of this nanocarrier as a promising tool for thetherapeutic application of these bioactive molecules in the development ofnewanti-infectious agents.
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